加壓素細菌內毒素分析方法學

摘 要：目的：建立加壓素細菌內毒素檢測方法。方法：采用靈敏度為0.25EU/ml的鱟試劑，以凝膠法定性測定xxx的細菌內毒素水平，通過干擾初篩試驗和干擾試驗對其檢測方法進行驗證；結論：凝膠法適用于xxx的內毒素定性檢測。

關鍵詞：細菌內毒素；凝膠法；多肽

實驗材料

樣品（s）：加壓素內毒素限制2.5EU/mg。

鱟試劑：湛江安度斯生物有限公司產品

批號：1209121 靈敏度：0.25EU/ml 規格：0.1ml/支

細菌內毒素檢查用水（W）：湛江安度斯生物有限公司產品

批號：1209230 規格：5ml/支

細菌內毒素國家標準品（NSE）：中國藥品生物制品鑒定所

批號：150601-201176 效價：100EU/支

孵育反應儀器：湛江安度斯生物有限公司產品 TAL-40型試管恒溫儀

無熱源空安瓿：湛江安度斯生物有限公司產品 規格：5ml/支

無熱源吸頭：湛江安度斯生物有限公司產品 規格：200ul/支、1000ul/支

移液器：DragonLAB 100～1000ul、20～200ul

天平：梅特勒 型號：MS105DU 精度：十萬分之一

其他：漩渦混合器、安瓿小護士、封口膜

1 實驗方法與步驟

1.1 樣品最大有效稀釋倍數（MVD）的計算：10mg樣品溶劑于10ml內毒素檢查用水中，L為質量標準限度值2.5EU/mg；λ為所選鱟試劑的靈敏度。

MVD=CL/λ =1×2.5/0.25=10倍

靈敏度0.25、0.125、0.06、0.03 EU/ml對應的MVD為10、20、40、80。

1.2 干擾初篩試驗：選擇0.25EU/ml鱟試劑進行實驗。

1.2.1 內毒素標準品（C）的制備：將NSE稀釋到4λ=1EU/ml、2λ=0.5EU/ml濃度溶液，記為E1、E0.5，備用。

1.2.2 供試品溶液（A）的制備

10mgS+10mlW→10.0mlS

0.5mlS+2.0mlW→2.5mlS0

1.0mlS0+1.0mlW→2.0mlS1

1.0mlS1+1.0mlW→2.0mlS2

1.0mlS2+1.0mlW→2.0mlS4

1.0mlS4+1.0mlW→2.0mlS8

1.0mlS8+1.0mlW→2.0mlS16

1.2.3 內毒素供試品溶液（B）的制備

0.5mlS1+0.5mlE1→1.0mlS2E0.5

0.5mlS2+0.5mlE1→1.0mlS4E0.5

0.5mlS4+0.5mlE1→1.0mlS8E0.5

0.5mlS8+0.5mlE1→1.0mlS16E0.5

1.2.4 結果：取鱟試劑分別與A、B及C溶液反應。另2支（D）加入0.1ml檢查用水。

結果：樣品、陰性對照為陰性，陽性對照為陽性，故試驗有效，且第一個樣品陽性結果的濃度即可初步般定位樣品的無干擾濃度。

1.3 干擾驗證試驗：選用0.25EU/ml鱟試劑進行實驗

1.3.1 內毒素溶液（C）制備：同1.2.1項下方法制備。

1.3.2 內毒素供試品（B）制備：取三批樣品分別按下法制備

0.5mlS1+0.5mlE1→1.0mlS2E0.5

0.5mlS1+0.5mlE0.5→1.0mlS2E0.25

0.5mlS1+0.5mlE0.25→1.0mlS2E0.125

0.5mlS1+0.5mlE0.125→1.0mlS2E0.06

1.3.3 取規格為0.1ml/支的鱟試劑36支，各加入0.1ml內毒素檢查用水。

1.3.4 加樣

將準備好的鱟試劑取其中18支（管）放在安瓿架上，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內毒素標準溶液，另一列2支（管）加入0.1ml檢查用水作為陰性對照。將另外18支（管）鱟試劑，排成5列，4列4支（管），1列2支（管）。其中的4支4列每列每支分別加入0.1ml的2λ、1λ、0.5λ、0.25λ的內毒素供試品溶液，另1列2支（管）加入0.1ml供試品溶液作為樣品陰性對照。

1.3.5 結果

表2 干擾驗證試驗結果

計算公式：Es=antilg（ΣXs/4） Et=antilg（ΣXt/4）

20121201 Es=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

Et=antilg[（lg0.25）×3+（lg0.125）]/4=0.21EU/ml

20121202 Es=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

Et=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

20121203 Es=antilg[（lg0.25）×4]/4=0.25EU/ml

Et=antilg[（lg0.25）×3+（lg0.125）]/4=0.21EU/ml

2結束語

3批樣品兩組最大濃度2λ管均為陽性，最低濃度0.25λ均為陰性，陰性對照4管均為陰性，Es在0.5λ～2λ之間，且0.5Es2.0Es，供試品在該濃度下不干擾試驗，可在該濃度下對此供試品進行細菌內毒素檢查。