過表達RI對膀胱癌移植瘤生長的影響

摘要：目的 探討過表達核糖核酸酶抑制因子(ribonuclease inhibitor，RI)基因對膀胱癌裸鼠移植瘤生長及血管表達的影響。方法 實驗分三組：T24-RI細胞組（過表達RI的T24細胞細胞組)、T24vector組(轉染陰性對照質粒的T24細胞)、T24組(正常T24細胞)。將pcDNA3.1-RI、pcDNA3.1-分別轉染人膀胱癌T24細胞，篩選穩定表達的T24細胞，將其注入裸鼠皮下，檢測裸鼠移植瘤的大小和質量，HE染色觀察移植瘤組織的形態學變化，利用免疫組化技術檢測移植瘤組織中微血管的變化。結果 T24-RI組較T24 vector組與T24細胞未轉染質粒組，瘤體質量顯著降低（P＜0.01）。T24-RI組癌細胞較T24 vector組與未轉染質粒組體積減小，T24-RI組微血管較T24 vector組與T24組明顯減少。結論 過表達人核糖核酸酶抑制因子基因RI，可以抑制膀胱癌裸鼠移植瘤的生長。

關鍵詞：核糖核酸酶抑制因子；膀胱癌；血管生成素；真核表達

人核糖核酸酶抑制因子是一個分子量為50kD的酸性蛋白，它具有7個亮氨酸殘疾重復片段組成的亮氨酸拉鏈（LRRs）結構。RI的功能就是識別并結合核糖核酸酶A，從而抑制其活性。具有LRR重復結構的一百多種蛋白顯示的包括DNA修復，細胞外基質相互作用，周期調控，信號傳導在內的多種生物學功能[1-4]。根據結構基因組學，我們推斷RI具有我們尚未發現的其他生物學功能。本實驗通過構建的過表達RI的載體，轉染并篩選穩定表達的克隆。從動物體內試驗探索RI基因的質粒對人膀胱癌生長的影響及其可能存在的機制。

1材料與方法

1.1主要材料和試劑膀胱癌T24細胞，T24 vector細胞，T24-RI細胞均來自本實驗室保存：SPF級BALB/C裸鼠購于北京大學動物實驗中心，由重慶醫科大學動物中心代為飼養。

兔抗人RI一抗由本實驗保存；免疫組化染色試劑盒，BAD染液購于北京中衫金錢生物技術有限公司。

1.2裸鼠移植瘤模型的構建立即將取下的瘤重一半放入液氮，一半放入4%多聚甲醛溶液中保存。抑制率=(1-實驗組瘤重/對照組瘤重)×100%；解剖裸鼠取肺部組織，放入4%多聚甲醛溶液中固定保存，用于HE染色觀察肺組織轉移情況。

1.3移植瘤肺組織，瘤組織HE染色 取4%多聚甲醛溶液固定的各組肺，瘤組織及人體膀胱癌組織，石蠟包埋，10μm切片。

1.4組織免疫熒光取液氮凍存的瘤組織，切片，冷丙酮固定，通透，BSA封閉，一抗CD31（1:100稀釋），4℃孵育過夜，PBS洗3遍，羊抗兔Dylight 488標記的山羊抗兔IgG（1:50）37℃避光孵育2h，PBS洗3遍，封片。于熒光顯微鏡下拍照。

1.5統計學分析采用SPSS 10.0軟件進行統計處理，數據以（x±s）表示，組間比較行方差分析及q檢驗。

2結果

2.1過表達RI對裸鼠移植瘤生長的影響T24組，T24 vector組，T24-RI組細胞注射裸鼠，35d后處死取瘤記重。T24組，T24 vector組，T24-RI組平均瘤重分別為（0.2727±0.073），（0.2635±0.164），（0.081833±0.062）。T24-RI組移植瘤的生長受到明顯抑制，同T24組，T24 vector組比較，抑制率分別為25.67% 和 37.85%。

圖1成功構建裸鼠移植瘤

a 裸鼠移植瘤；b 裸鼠成瘤質量分析

2.2組織免疫熒光觀察各組移植瘤血管的變化如圖2，CD31抗體在T24-RI組中弱陽性，在T24組，T24 vector組成強陽性，表明T24-RI組移植瘤中微血管的明顯少于T24組，T24 vector組。

圖2CD31檢測瘤組織微血管生成情況

2.3肺組織HE染色檢測各組癌細胞轉移情況T24-RI組肺組織未見明顯轉移， T24組，T24 vector組在血管周圍均可見到細胞核增大，細胞核染色加深的細胞團，表明癌細胞向肺組織轉移。

3討論

將T24，T24 vector，T24-RI三組細胞皮下注射裸鼠后，取形成的移植瘤稱重發現，T24-RI組瘤重明顯輕與其他兩對照組，HE染色結果顯示，兩對照組中細胞核染色加深，核質比例加大，核分裂相增多，微血管明顯多于T24-RI組，說明RI基因在體內抑制了癌細胞的增殖及微血管的發生從而抑制腫瘤的生長。

綜上所述，動物體內實驗證明RI基因可以有效抑制血管生長，抑制腫瘤的生長。探索RI抑制血管的作用和機制，為進一步闡明RI基因的功能，尋找新的腫瘤血管抑制靶基因和藥物提供科學依據和理論線索。

參考文獻：

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編輯/哈濤