銀杏葉提取物聯合噻嗎洛爾對視網膜神經節細胞損傷的影響

摘要：目的觀察銀杏葉提取物(Extract of Ginkgo Biloba Leaves，EGb)聯合馬來酸噻嗎洛爾對大鼠慢性高眼壓視網膜神經節細胞(retinal ganglion cells，RGCs)損傷的影響。方法選取健康SD大鼠50只，挑選平均眼壓在正常眼壓波動范圍者45只納入實驗，再隨機挑選10只為正常組，其余35采用烙閉3條鞏膜上靜脈的方法制作大鼠慢性高眼壓模型。從中選出眼壓穩定在實驗要求的大鼠30只隨機分為生理鹽水組、用藥組及聯合用藥組，各10只。所有大鼠8w后處死，制作光鏡及電鏡切片。電鏡下觀察視網膜神經節細胞超微結構的變化；AgNOR染色檢測RGCs的活性；TUNEL法檢測RGCs凋亡。結果生理鹽水組神經節細胞在電子顯微鏡下結構嚴重受損，神經節細胞受損，治療組和聯合組神經節細胞結構只有微小的變化。正常組和聯合治療組RGCs銀染料粒子數量的核相比沒有顯著性差異(P st13 0.05);生理鹽水組和藥物組RGCs銀核染色顆粒顯著降低，與正常組和聯合治療組相比，有顯著性差異(P﹤0.05)，使用生理鹽水組，也有顯著性差異(P﹤0.05)。結論EGb對大鼠慢性高眼壓導致的視網膜神經節細胞的損傷有一定的保護作用，聯合馬來酸噻嗎洛爾控制眼壓，對大鼠視網膜神經節細胞的保護作用更突出。

關鍵詞：銀杏葉提取物；馬來酸噻嗎洛爾；慢性高眼壓；視網膜神經節細胞

青光眼視神經損傷機制目前尚未闡明，隨著基礎研究的深入，人們發現不管損傷機制如何，它們最后的共同通路都是RGCs的凋亡[1]。臨床上青光眼患者雖然經藥物或手術降低了眼壓， 但RGCs的凋亡、視神經的損傷常常繼續發展， 甚至導致視力喪失。因此在控制眼壓的同時， 阻斷或降低RGCs的凋亡， 已成為青光眼治療的研究方向。我們通過建立大鼠慢性高眼壓模型，以EGb聯合噻嗎洛爾進行干預，觀察EGb聯合噻嗎洛爾對大鼠慢性高眼壓視網膜神經節細胞損傷的影響，以期為青光眼的防治尋找新的方法。

1資料與方法

1.1一般資料健康SD(Sprague-Dawlay)大鼠50只（由懷化醫學高等?？茖W校實驗動物學部提供），雌雄兼用，體重200～240g，8～12w齡，經檢查無明顯歪頸，角膜透明，虹膜血管清晰，瞳孔等大等圓，對光反應靈敏。TONO-PEN筆式眼壓計 ，雙目手術顯微鏡 ，眼科手術顯微鏡，電子分析天平，透射電鏡 ，銀杏葉提取物，馬來酸噻嗎洛爾眼液，AgNOR染色，TUNEL試劑盒。

1.2方法正式實驗前常規飼養3d，定期測眼壓， 挑選出平均眼壓在正常眼壓波動范圍（9～16mmHg）者45只納入實驗。45只SD大鼠隨機挑選10只為正常組，其余35只采用烙閉3條新方法使老鼠在鞏膜靜脈慢性高眼壓模型[2]。體積分數為10%水合氯醛麻醉大鼠腹腔內注射0.3ml/kg的深度，1%地卡因眼行兩次眼表面麻醉，切開顯微鏡和右顳結膜鞏膜暴露淺靜脈，鼠眼球鼻側，顳側，顳淺靜脈和顳下各有一個，走線更直，燃燒在時間方面，時間和第三條下顳淺靜脈，立即收縮血管，其遠端血流中斷，結膜切口不做縫合，結膜囊內涂典必殊眼膏。觀察1w，定期測量眼壓，從中選出眼壓穩定在實驗要求（眼壓＞24 mmHg）的大鼠30只隨機分為生理鹽水組、用藥組及聯合用藥組，各10只。光鏡下觀察RGCs細胞核內黑色銀染顆粒情況。選擇每個切片中的4個不同高倍視野進行圖象分析，計數銀染顆粒（計數RGCs細胞核內銀染顆?？倲岛蚏GCs個數，計算出單個節細胞內銀染顆粒平均個數），求4個視野的平均值。隨機在每組取18張切片(每標本取2張)，切片脫蠟用二甲苯浸洗2次，嚴格按照TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒的說明進行操作，每個片在四個不同的圖像分析角度來看，高功率雙筒顯微鏡(400倍)，計算凋亡陽性細胞和神經節細胞的總數，每組陽性細胞的平均數量和平均總數量的細胞，細胞凋亡指數(AI)、人工智能(%)=凋亡細胞數/總×100%。

1.3統計學處理所有數據均以均值±標準差(x±s)表示，采用SPSS17.0軟件包行兩樣本均數t檢驗及單因素方差分析(LSD法)，P<0.05認為差異有統計學意義。

2結果

2.1電鏡下觀察大鼠視網膜神經節細胞超微結構的變化正常組:正常視網膜神經節細胞的結構是明確的。神經節細胞胞核圓形或卵圓形，中心，染色質清晰，顏色均勻分布，胞漿豐富的細胞器，線粒體及其峰值，核糖體，內質網正常形式，細胞膜的完整性。治療組:一些神經節細胞核染色質聚集，胞質細胞器在線粒體數量略少，糙面內質網和核糖體，線粒體腫脹的一部分，內質網空泡變性，部分線粒體嵴消失，細胞膜的完整性。

2.2 AgNOR染色可見細胞質和細胞外組織被染成黃色，染細胞核，邊界清晰，細胞核的色散可以看到一個或多個AgNOR小黑點，有時可見許多微小粒子合并成不規則的面包屑。正常組和聯合治療組大鼠眼RGCs核銀染料顆粒分布均勻，可數量的銀染色粒子在兩組之間沒有顯著性差異(P st13 0.05);生理鹽水組和治療組大鼠眼RGCs銀核染色顆粒顯著降低，與正常組和聯合治療組相比，有顯著性差異(P﹤0.05)，包括藥物RGCs銀染色粒子在原子核鹽水組，也有顯著性差異(P﹤0.05)。

2.3 TUNEL法檢測RGCs凋亡結果光學顯微鏡下TUNEL陽性表達為細胞核呈棕黃色。正常組大鼠眼視網膜神經節細胞層偶爾TUNEL陽性細胞，積極核淺;生理鹽水組大鼠眼視網膜神經節細胞層TUNEL陽性細胞的數量明顯增加，陽性細胞染色深，人工智能與正常組相比有顯著性差異(P<0.05);眼藥物組和聯合治療組大鼠TUNEL陽性細胞數量小于生理鹽水組，陽性細胞核是淺，人工智能與正常組和生理鹽水組相比差異顯著(P<0.05);人工智能組合組AI與觀察組相比有顯著性差異(P<0.05)。

3討論

青光眼是一組以特征性視神經萎縮和視野缺損為共同特征的疾病，長期以來一直認為青光眼是由神經視神經疾病以外的因素造成的。最普遍認為高眼壓青光眼的發病機制是最危險的因素，所以在過去的很多研究專注于降低眼壓。然而，許多甚至青光眼患者眼壓降至正常范圍，神經損傷持續[3，4]，視力還迷路。這些現象表明，高眼壓不是唯一的因素，青光眼可能還有其他危險因素。通過基礎和臨床研究的積累和深化，人們青光眼有更深層次的理解，認為青光眼視功能損傷是多種因素的結果，機制，純粹從降低眼壓青光眼治療的角度可能延緩疾病的發展和減少視覺受損，但沒有足夠的治療[5]。因此，青光眼的治療應該在降低眼壓的基礎上使用特殊方法推遲或阻止視神經損傷和保護視力。為數眾多的研究已經表明，青光眼視神經的損害是由于視網膜神經節細胞凋亡，是不可逆轉的視力損害的主要原因，高眼壓或低血流灌注壓力導致缺血、缺氧，等等，光纖神經軸漿流中斷，進一步導致供應中斷目標源性神經營養因子，同時產生更多的興奮性毒素，并誘導細胞凋亡基因激活的同時，作用于細胞表面受體，如NMDA受體，出現大量的鈣離子內流，鈣超載，通過細胞內信號傳導，引起一系列的級聯反應，最終導致DNA，細胞變性凋亡發生，導致青光眼視神經損害[6]。

我們采用烙閉大鼠3條鞏膜上靜脈的方法建立大鼠慢性高眼壓模型，參照EGb的藥物安全劑量及先前對EGb的研究[10]，用灌胃的方式(150mg/kg)，1次/d，聯合馬來酸噻嗎洛爾眼液進行視神經的保護性干預，結果表明:電子顯微鏡下正常組視網膜神經節細胞結構清晰，神經節細胞大量死亡生理鹽水組，細胞邊界不清楚，核固縮、胞質空泡，細胞器消失，大部分治療組神經節細胞也嚴重退化，但沒有看到一群死細胞和炎癥細胞，在聯合治療組和神經節細胞只有輕微損傷;AgNOR染色正常組和聯合治療組大鼠眼RGCs顆粒分布均勻，可銀染色細胞核的兩組之間沒有顯著差異銀染料顆粒數量(P st13 0.05)，與生理鹽水組和治療組大鼠眼RGCs銀染色的核粒子顯著降低，與正常組和聯合治療組相比，有顯著性差異(P﹤0.05)，治療組與生理鹽水組相比RGCs銀核染色顆粒，也有顯著性差異(P﹤0.05)。TUNEL法檢測AI RGCs凋亡的結果從高到低依次是生理鹽水組、治療組和聯合組和正常組，比較兩個顯著(P﹤0.05)。這些有力地證明了，EGb能阻斷慢性高眼壓狀態下視網膜神經節細胞凋亡的發生，對視網膜神經節細胞有一定的保護作用，聯合馬來酸噻嗎洛爾眼液控制眼壓，這種保護作用更為突出。

參考文獻:

[1]Nickells RW .Retinal ganglion cell death in glaucoma: the how，the why，and the maybe [J].J Glaucoma，1996，5:345.

[2]段曉明，徐冬冬，王帥，等.大鼠慢性高眼壓模型的實驗研究[J].東南大學學報( 醫學版)，2011，30(3):422-426.

[3]夏翠然.青光眼視網膜神經節細胞損傷及保護[J].國外醫學·眼科學分冊，2001，25(1):36.

[4]包輝英，吳國忠.中藥治療青光眼研究進展[J].實用中醫藥雜志，2004，20（5）：278.

[5]葛堅.青光眼的研究進展與發展趨勢[J].中華眼科雜志，2000，36（3）：192-196.

編輯/申磊