AKT在Ghrelin抑制結腸癌細胞凋亡中的作用

摘要：目的觀察生長激素釋放肽(growth hormone releasing peptide， Ghrelin)對人結腸癌RKO細胞凋亡的影響及可能機制。方法5-氟尿嘧啶（5-FU）聯合Ghrelin作用人結腸癌RKO細胞及預處理AKT抑制劑wortmannin后再作用RKO細胞，Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測細胞增殖；熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡；Western blotting檢測結腸癌細胞中p-AKT蛋白表達。結果Ghrelin可削弱5-FU對RKO細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，而渥曼青霉素（wortmannin）可顯著抑制Ghrelin對體外結腸癌RKO細胞的保護作用；Ghrelin可促進p-AKT蛋白在RKO細胞中的表達，該作用可被wortmannin阻斷。結論Ghrelin可顯著抑制體外結腸癌RKO細胞凋亡，該作用可能通過促進AKT磷酸化的表達而實現，Ghrelin可能作為結腸癌治療中新的抗癌靶點。

關鍵詞：結腸癌；Ghrelin；AKT

Ghrelin Inhibit Cell Apoptosis in Human Colorectal Cancer Cell Line RKO Via AKT Pathway

TANG Zhen， LIU An， TANG Min

(Institute of Orthpaedics， Yueyang Hospital， The Medical College of Xiangya， The Central South University， Yueyang 414000，Hunan，China)

Abstract：ObjectiveTo investigate the anti-apoptotic effect and the mechanism of Ghrelin in human colorectal cancer cell line RKO in vitro. MethodsAfter human colorectal cancer cell line RKO was 5-FU treatment to induce apoptosis and simultaneously treated with Ghrelin in the presence or absence of wortmannin， a highly specific inhibitor of AKT. The cellular proliferation was detected by Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay. The morphological changes of RKO cells were observed under the fluorescence microscopy after DAPI staining. Western blotting was used to detect the expression of p-AKT in RKO cells. ResultsGhrelin prevented apoptosis in RKO cells induced by 5-FU. However， wortmannin abolished Ghrelin' s cytoprotective activity after 5-FU treatment. Ghrelin treatment markedly increased AKT activation in RKO cells， and this was completely suppressed by coincubation with wortmannin. ConclusionGhrelin may act as a survival factor in RKO cells through the activation of AKT， and Ghrelin might become a potential therapeutic target of colorectal cancer.

Key words： Colorectal cancer; Ghrelin; AKT

Ghrelin作為一種生長激素促泌劑受體的內源性配體，其大部分由胃腸道上皮細胞分泌，自從Ghrelin被發現以來，就被證實在包括控制進食和新陳代謝等多種生理及病理活動中也發揮了關鍵作用。近來來研究表明，Ghrelin在前列腺癌[1]、胃癌[2]和肝癌[3]等多種惡性腫瘤細胞中表達升高，同時對乳腺癌及前列腺癌細胞凋亡有一定抑制作用[4]，其作用機制尚不十分明確，且目前尚未有Ghrelin對結腸癌細胞凋亡作用的研究報道。為此，本研究擬探討Ghrelin對體外人結腸癌細胞株RKO凋亡的影響及可能機制，為臨床提供有價值的參考指標。

1資料與方法

1.1一般資料胎牛血清、RPMI-1640培養基和含0.25%EDTA胰蛋白酶購自美國Gibco公司；CCK-8試劑盒、DAPI和BCA蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所；Ghrelin購自美國Biovisin公司；p-AKT和AKT抗體購自美國Santa Cruz公司；AKT特異性抑制劑wortmannin購自美國Sigma公司；5-氟尿嘧啶（5-FU）購自上海旭東海普藥業有限公司。

1.2細胞培養人結腸癌細胞株RKO購自ATCC，細胞生長于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，含1%的青-鏈霉素，在5％CO2，37℃培養箱內孵育，胰蛋白酶消化傳代，取對數生長期細胞為實驗對象。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖收集處于對數生長期的RKO細胞，制成單細胞懸液，調整細胞濃度為5×105/ml，接種于96孔細胞培養板中，每孔10 μL，待細胞過夜貼壁后，分別加入5-FU(40 nmol·L-1)或5-FU(40 nmol·L-1)+Ghrelin（10 nmol·L-1）作用24h及預處理wortmannin（200 nmol·L-1）1h后再經5-FU(40 nmol·L-1)+Ghrelin（10 nmol·L-1）作用24h，更換新鮮培養液，每孔加入10 μL CCK-8 細胞計數試劑，于培養箱內孵育4h后置酶標儀450 nm下讀取吸光度A值。同時設置空白調零組（不加細胞加入等量的PBS），以及陰性對照組（加入等量的生理鹽水），實驗重復3次。

細胞存活率=（實驗組A450值-空白調零組A450值）/（對照組A450值-空白調零組A450值）×100％

1.4細胞形態學觀察取1 ml濃度為1×106/L的RKO細胞懸液接種于載玻片上，待過夜細胞貼壁后更換培養液，藥物處理同CCK-8法。甲醛固定后，經DAPI染色5 min，置熒光顯微鏡（OLYMPUS， BX51TF）下觀察。

1.5 Western blot檢測RKO細胞中p-AKT的表達收集對數生長期的RKO細胞，細胞經Ghrelin（10 nmol·L-1）作用24h、wortmannin（200 nmol·L-1）作用1h及預處理wortmannin（200 nmol·L-1）1h再加Ghrelin（10 nmol·L-1）作用24h后，裂解細胞并分離細胞蛋白質，用Bradford法測量蛋白濃度后取等量蛋白質樣品（20μg/孔），常規8% SDS-PAGE電泳，半干轉膜儀轉膜，5%脫脂奶粉封閉，加入p-AKT-抗（1：1000）于4℃下孵育過夜，HRP標記的羊抗兔IgG為第二抗體（1：2500）室溫孵育1h，ECL顯色，條帶暴光強度用Quantity One 4.6.2(BIO， RAD)軟件分析，以AKT為內參，通過與內參的灰度比，得出目的條帶的相對表達水平。

1.6數據的統計處理實驗所得計量數據均以均數±標準差(x±s) 的形式表示，采用SPSS 11．0統計軟件進行檢驗分析，以P<0.05時為差異有統計學意義。

2結果

2．1 Ghrelin對體外結腸癌RKO細胞增殖的影響RKO細胞經5-FU(40 nmol·L-1)或5-FU(40 nmol·L-1)聯合Ghrelin（10 nmol·L-1）作用24 h后，細胞存活率分別為34.65%和86.42%，兩者相比較有統計學差異（P<0.05）；而wortmannin預處理1 h，細胞再經5-FU(40 nmol·L-1)+Ghrelin（10 nmol·L-1）作用24 h后細胞存活率為47.28%，與5-FU聯合Ghrelin組相比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

2．2 Ghrelin對結腸癌RKO細胞凋亡的影響細胞經DAPI染色后，熒光顯微鏡下觀察到正常RKO細胞核完整，形態規則（圖1A），5-FU處理后多數細胞核出現明顯固縮和染色體凝集等凋亡特征性改變（圖1B），表明5-FU可顯著誘導RKO細胞凋亡；5-FU聯合Ghrelin作用RKO細胞后少量細胞出現凋亡（圖1C）；RKO細胞經wortmannin預處理再經5-FU+Ghrelin作用后凋亡細胞明顯增多，并出現大量凋亡小體（圖1D）。為排除wortmannin對RKO細胞增殖和凋亡的影響，預實驗表明，wortmannin（200 nmol·L-1）單獨作用1 h對RKO細胞無明顯增殖抑制和凋亡誘導作用。

圖1AKT抑制劑wortmannin對Ghrelin抗凋亡作用的影響

細胞經DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察到細胞形態學改變，箭頭示典型凋亡細胞（×400）。

2．3 Ghrelin對RKO細胞中p-AKT蛋白表達的影響如圖2所示，Western blot檢測結果表明wortmannin（200 nmol·L-1）作用1h后RKO細胞中p-AKT的相對表達量為1.29±0.24，與對照組（2.25±0.52）相比較，差異有統計學意義（P<0.05）；而Ghrelin作用后RKO細胞中p-AKT的相對表達量為6.84±1.34，與對照組相比較，有顯著性差異（P<0.05）；wortmannin預處理后再經Ghrelin作用的RKO細胞中p-AKT的相對表達量為3.43±0.48，與Ghrelin單藥組相比較，有顯著性差異（P<0.05）。

圖2 Western blotting檢測Ghrelin對結腸癌RKO細胞中p-AKT蛋白表達的影響，以AKT為內參

3討論

Ghrelin是1999年由日本Kojima等發現的生長激素促泌劑受體的內源性配體，為含有28個氨基酸的活性多肽，Ghrelin與受體結合后可產生廣泛的生物學效應，如促進生長激素分泌、減少脂肪利用、維持能量正平衡等[5]。另外，Ghrelin還可促進胃酸分泌，增加胃腸蠕動和保護心臟等作用[6，7]。研究表明嬰兒和胎兒有大量的Ghrelin生成細胞，但隨年齡增長Ghrelin分泌細胞不斷減少[8]，從而提示Ghrelin與細胞增殖和分化有一定聯系。2002年，Murata等首先報道Ghrelin與肝癌細胞的惡性增殖有一定聯系[3]；在隨后的研究中，更多研究表明Ghrelin在促進多種惡性腫瘤細胞增殖及抑制腫瘤細胞凋亡中發揮了巨大作用[1，2，4]，但目前尚未有Ghrelin對結腸癌細胞凋亡的研究報道。在本研究中，5-FU作用RKO細胞后可顯著抑制細胞增殖和促進細胞凋亡，而Ghrelin聯合5-FU作用結腸癌細胞后凋亡細胞明顯減少，表明Ghrelin在結腸癌細胞株RKO中充當細胞保護性因子，并可明顯抑制5-FU對結腸癌細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用。

PI-3K/AKT通路是細胞內廣泛存在的重要信號傳導通路，該通路的激活可通過影響下游多種效應分子的活化狀態，從而導致諸如自身免疫病和糖尿病等多種疾病的發生。另外，PI-3K/AKT通路在惡性腫瘤的發生和發展、促進腫瘤的侵襲和轉移以及腫瘤的免疫逃逸中發揮了關鍵的作用。在PI-3K/AKT通路中，AKT是信號轉導通路中最重要的中心環節，AKT的活化依賴于其上游分子PDK來完成蘇氨酸磷酸化位點(Thr308)和絲氨酸磷酸化位點(Ser473)的磷酸化，p-AKT通過作用于其各種下游分子從而促進細胞增殖和抑制細胞凋亡[9]。渥曼青霉素（wortmannin）是一種常用PI-3K/AKT通路特異性抑制劑，它可以通過細胞膜與胞內PI-3K的110 KD催化亞基相結合而特異性地抑制PI-3K/AKT信號傳導通路[10]。在本研究中，為探討Ghrelin對結腸癌細胞的抗凋亡作用機制，本研究使用wortmannin作用RKO細胞，觀察wortmannin對Ghrelin抗凋亡作用的影響。細胞增殖和細胞凋亡實驗結果表明，預處理wortmannin后Ghrelin抗凋亡作用明顯下降，提示PI-3K/AKT通路在Ghrelin抗結腸癌RKO細胞凋亡中發揮了重要作用。同時本研究通過檢測AKT在Ser473位點的磷酸化，以此來反映AKT的活化狀態，蛋白印記結果也表明，Ghrelin作用后p-AKT在RKO細胞中的表達明顯升高，表明AKT的活化在Ghrelin發揮抗結腸癌細胞凋亡中的作用。另外，wortmannin預處理RKO細胞后可明顯抑制Ghrelin對AKT的活化作用，與細胞增殖實驗和細胞凋亡結果相吻合，進一步表明，PI-3K/AKT通路的活化在Ghrelin抗結腸癌細胞凋亡中發揮了關鍵作用，與文獻報道相近[11]。

綜上所述，本研究表明Ghrelin可有效抑制5-FU對結腸癌RKO細胞的增殖抑制和凋亡誘導作用，其作用機制與PI-3K/AKT通路的活化密切相關。而Ghrelin可能作為結腸癌治療中新的抗癌靶點，具體作用機制仍需進一步研究證實。

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編輯/申磊