川崎病急性期血細胞因子的變化

摘要：目的 為臨床提供較好的兒童川崎病急性期細胞因子濃度變化的證據。方法 采被試兒童包括KD組（32例）和對照組（32例）靜脈血，測定血樣標本中腫瘤壞死因子-α（TNF-α），干擾素-γ（INF-γ）和白細胞介素-12（IL-12）的含量。并用獨立樣本t檢驗分析兩組兒童外周血中三種細胞因子是否有顯著性差異。結果 通過計算實驗組患兒外周血TNF-α，INF-γ和IL-12的含量均高于對照組兒童。結論 通過對TNF-α，INF-γ和IL-12的監測，可以有效的了解畸川病患兒疾病進展，治療效果和預后情況。

關鍵詞：川崎病；腫瘤壞死因子-α；干擾素-γ；白細胞介素-12

川崎病(KD)又名皮膚粘膜淋巴結綜合征，是一種原因不明確的兒童常見的自身免疫性血管炎綜合征，其主要并發癥為嚴重的心血管系統損害，尤其是冠狀動脈病變，目前在美國、日本及我國川畸病已取代了急性風濕病作為兒童后天獲得性心臟病的最主要原因[1]。近年，細胞因子如腫瘤壞死因子-α（TNF-α），干擾素-γ（INF-γ）和白細胞介素-12（IL-12）在川崎病診斷、鑒別診斷及療效判斷中受到關注。本研究對32例川崎病急性期患兒靜脈血中三種細胞因了的檢測，現報告如下：

1資料與方法

1.1一般資料 2011年6月到2013年6月，到我院診治的32名川畸病患兒為實驗組。根據臨床表現以及血液學和影像學提示，32例患兒均符合急性期KD的診斷標準[2]。其中男18例，女14例，中位年齡6.5（2～15歲）。對照組選擇同期到我院體檢中心體檢的正常兒童，共32例，男女比例選擇與實驗組相似。男19例，女12例，中位年齡7.1（2～16）。

1.2方法

1.2.1標本收集 用肝素鈉抗凝管采集患者和對照組兒童的靜脈血10ml.其中5ml用于TNF-α，另5ml用于IL-12的測定。再取用無肝素采集管采集15ml用于INF-γ測定。

1.2.2 TNF-α含量的測定 以鼠源性的抗TNF-α單抗以每孔400ng的量，在PH9的碳酸-碳酸鈉緩沖液中包被96孔板中，并4℃過夜。取出后洗滌3次，加入預先備好的待測樣本及標準的TNF-α(制作標準曲線用)。37℃孵育2h。用洗滌液洗滌3次，加入羊抗鼠TNF-α抗體，37℃孵育2h后，再洗滌3次，加入辣根過氧化物酶標記的兔抗羊IgG，37℃孵育2h后加入底物顯色。終止顯色后在自動酶標儀上測定濃度，并以標準曲線為基準求得TNF-α的含量。以Mean±SDng/ml的形式表示結果。

1.2.3 INF-γ含量測定 將上述采得的用于INF-γ測定的靜脈血在室溫凝固30min，1000r/min離心15min，收集血清。檢測IFN-α用人IFN-α檢測Elisa試劑盒，操作步驟為分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準品準確加樣50μl，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。用封板膜封板后置37℃溫育30min。將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。再用封板膜封板后置37℃溫育30min。小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30s后棄去，如此重復5次，拍干。每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15min。每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。以空白孔調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。終止顯色后在自動酶標儀上測定濃度，并以標準曲線為基準求得IFN-α的含量。以Mean±SD ng/ml的形式表示結果.

1.2.4IL-12含量測定 酶聯免疫吸附試驗(ELBA)試劑盒購自武漢博士德試劑公司，其他常規試劑由實驗中心配置，全自動酶標儀由意大利希亞克公司生產。采用雙抗體夾心ELISA測定血清IL-12的濃度，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書。采用速率散射比濁法檢測hs-CRP和CP含量，使用Beckman公司Array一360特定蛋白分析儀，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書。

1.3統計學方法 采用SPSS 13．0統計軟件。計量資料采用均x±s表示，采用獨立樣本t檢驗比較對照組和不同時間窗KD組的細胞因子的差異。以P＜0.05 為差異有顯著性。

2結果

2.1TNF-α含量的對比結果 KD組患兒外周血中TNF-α含量的平均值是：(56.31±20.12) ng/ml，而對照組的患兒的平均值為(25.28±10.41 )ng/ml。通過獨立樣本t檢驗分析，P=0.008＜0.05，差異具有顯著性。

2.2 INF-γ含量的對比結果 KD組患兒外周血中INF-γ含量的平均值是：(22.2±9.42)ng/ml，而對照組的患兒的平均值為(8.37±10.21)ng/ml。通過獨立樣本t檢驗分析，P=0.001＜0.05。

2.3 IL-12含量的對比結果 KD組患兒IL-12含量平均為：(35.64±14.16)pg/ml，對照組患兒外周血中IL-12含量平均為：(21.02±4.50)pg/ml。通過獨立樣本t檢驗分析，P=0.012＜0.05。

3討論

川崎病(KD)是兒童期一種常見免疫相關性血管炎綜合征，有逐年增多趨勢，目前認為KD是小兒獲得性心臟病的主要病因[3]。到目前為止雖然川崎病精確的發病機制還沒有被完全的闡明，但是大量證據表明Ｔ細胞介導的免疫調節異常在川崎病的發病機理中發揮了重要的作用。

腫瘤壞死因子，是目前為止抗腫瘤能力最強的細胞因子，也是被研究得最多。它是單核-巨噬細胞分泌的單核細胞刺激因子，在炎癥和免疫反應中起著重要的作用。研究表明，川崎病患者體內TNF的含量有明顯增加[4]。在正常情況下 ，TNF-α濃度較低，適量的TNF-α對機體有保護作用，在疾病的病理改變下，TNF-α大量分泌，以致對機體產生損害作用。至于是否還有其它因素影響，尚待進一步探討[5]。本研究的結果為川崎病兒童體內外周血TNF-α含量顯著高于正常兒童含量提供了臨床依據。

INF-γ主要由輔助T(Th)細胞產生，INF-γ是可調節Th細胞極化的細胞因子 。在這種調節機制中， 細胞分泌的INF-γ 發揮著十分重要的作用，能顯著地促進Th1應答，且抑制Th2應答[6]。升高的機理可能是患兒血清中血管內皮生長因子水平明顯低于正常患兒，也可能是由于患兒外周血T、B淋巴細胞調節紊亂，機體的免疫功能發生川崎病的原因。在我們這次研究中，也可以看到川崎病患兒外周血中的INF-γ的含量與對照組患兒體內INF-γ的含量差異具有顯著性。這里后期應該追加急性川崎病和慢性川崎病患兒體內外周血INF-γ含量比較的研究，以提供更完善的證據證明INF-γ的含量可以反映再障疾病的嚴重程度。

IL-12是啟動Th1細胞的重要因子。而IL-12協同其他的細胞因子組成的細胞因子網可以決定機體免疫應答的類型。本次研究的結果顯示川崎病患兒外周血IL-12的含量明顯高于對照組正常兒童的含量。提示IL-12在川崎病的發生、發展的過程中具有一定的作用。已經有研究證實，IL-12可以誘導Th1細胞分泌INF-γ[7]。本次研究只是做了川崎病患兒與正常兒童IL-2的差別的研究，并沒有研究IL-2含量的高低與病情嚴重程度的關系。要得到這方面的結果，需在今后的研究中進行急慢性川崎病患兒細胞因子的對比和相關性研究。

綜上所述，在川崎病患兒的疾病發展過程中，通過對TNF-α、INF-γ和IL-2的監測，可以有效的了解疾病的病情、治療效果和疾病的預后，具有重要的臨床意義。本次研究的結果，為研究川崎病的新治療靶點提供了有效的臨床依據。同時，也啟發我們發現了一些新的研究思路，有助于我們將來更好的認識，特別是兒童這個特殊群體的川崎病。

參考文獻:

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編輯/許言