論著辛伐他汀聯合PMA對SHI-1細胞增殖與凋亡的影響

摘要： 目的探討羥甲基戊二酸單酰輔酶A（HMG-CoA）還原酶的抑制劑辛伐他汀（SV）聯合佛波酯（PMA）對SHI-1細胞增殖，分化與凋亡的影響，以及WT1/hDMP1基因的表達變化。 方法以不同濃度辛伐他汀單獨或聯合PMA處理SHI-1細胞，取對數生長期細胞進行實驗。各組細胞分別進行MTT法觀察細胞增殖能力；流式細胞測定SHI-1細胞凋亡指標AnnexinⅤ/propidium iodide變化； Real-time RT-PCR測定WT1/hDMP1基因表達變化。結果 15μmol/LSV，10μmol/LSV單獨處理SHI-1細胞，隨著培養時間延長，細胞抑制率增加（F=24.61，P=0.000），AnnexinV表達水平逐漸增高（F=5.69，P=0.018），WT1表達水平逐漸降低（F=12.20，P=0.008），同時伴隨著hDMP1表達水平的增加（F=23.81，P=0.000），其中以15μmol/LSV聯合PMA處理SHI-1細胞培養72h細胞抑制率最為明顯。結論辛伐他汀體外抑制SHI-1細胞的增殖，促進SHI-1細胞的分化及凋亡，降低WT1表達，升高hDMP1表達，提示辛伐他汀具有協同治療急性單核細胞白血病的潛能。

關鍵詞：辛伐他汀；SHI-1細胞；佛波酯；增殖；凋亡；WT1；hDMP1

Proliferation and Apoptosis Effects of Simvastatin Combined with PMA in Human Monocytic Leukemia Cell Line SHI-1

JIANG Ting-xiu1， CHEN Hong1，GU Wei-ying2， QIU Guo-qiang2， WANG Zhi-lin2， HE Bai2

（1.Department of Hematology ，The forth affiliated hospital of Guangxi Medical University，Liuzhou 545005，Guangxi，China;2.Department of Hematology，The First People，s Hospital of Changzhou， Third Affiliated Hospital of Suzhou University，Changzhou 213003，Jiangsu，China）

Abstract：ObjectiveTo investigate the effect ofSimvastatin(SV) combined with Phorbol-12-myristate-13-acetate(PMA) on the proliferation ，differentiation，apoptosis and WT1/hDMP1 gene expression profiles of human monocytic leukemia cell line SHI-1. MethodsSHI-1 cells were incubated with Simvastatin and PMA solely or in combination， Cells of different groups were collected after incubation for further detection．M'IT method was used to assay the growth inhibition rate and cytoflowmetry was used to detect the early stage apoptosis ratio and cell necrosis ratio．Real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR) was used to detect the WT1/hDMP1 gene expression levels. ResultsTreated with 15μmol/LSV and 10μmol/LSV in each， with the SHI-1 cells growth， the cell inhibition rates gradually increased(F=24.61，P=0.000)， and AnnexinV expression levels(F=5.69，P=0.018)， however the WT1 expression levels gradually decreased (F=12.20，P=0.008)，paralleled with hDMP1 expressionlevels increased in reverse(F=23.81，P=0.000)，furthermore the SHI-1 cells treated with Combination of 15μmol/LSV with 5ng/L PMA displayed obvious interaction for cell growth inhibition and Annexin V expression were found.ConclusionSimvastatin in vitro inhibited SHI-1 cell proliferation， induced cell differentiation and promoted cell apotosis， as well as decreased the WT1 expression and increased hDMP1 expression dose-dependently， indicating that simvastatin has the synergistic anti-monocytic potency in vitro.

Key words：Simvastatin;SHI-1 cell;Phorbol-12-myristate-13-acetate;Proliferation;Apoptosis;WT1; hDMP1

辛伐他汀（SV）作為羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-coA)還原酶的抑制劑已普遍用于臨床治療高膽固醇血癥。現在已有證據表明SV具有多效性，除了降低血脂外，還具有抑制細胞增殖、誘導凋亡、抗血管生成、抑制腫瘤細胞遷移等生物學作用[1]。目前文獻關于辛伐他汀體外抑制急性單核細胞白血病效應報道甚少，因此，本實驗通過分子生物學手段觀察辛伐他汀對SHI-1細胞增殖、分化和凋亡及WT1/hDMP1基因表達變化，以進一步探討辛伐他汀抗急性單核細胞白血病效應及可能的機制。

1資料與方法

1.1細胞的培養與實驗分組 人急性單核白血病細胞株SHI-1為蘇州大學血液研究所陳蘇寧博士惠贈。在10%FBS的1640培養基中培養，置37℃、5%二氧化碳培養箱中，每3d換液1次。取對數期細胞，調整濃度至2×l05/mL，辛伐他汀分15μmol/L (15SV)，10μmol/L(10SV)兩個濃度梯度，PMA為5ng/L。實驗分組如下： 15μmol/L SV組、10μmol/L SV組、PMA組、PMA+15μmol/L SV組、PMA+10μmol/L SV組、以SHI-1細胞為空白對照組。藥物作用24h，48h，72 h后收集各組細胞用于檢測。

1.2方法

1.2.1MTT法檢驗藥物對SHI-1細胞抑制作用將對數生長期的SHI-1細胞接種于96孔板中，濃度為2×105/ml，然后加入不同濃度的SV和PMA，每孔100μL，分組如上所述，每組有3個復孔。空白對照孔加RPMI 1640培養液100μL。培養24，48，72 h后，分別加入5mg/mL MTT液15μL，再37℃孵育4 h后加入0.04 mmol/L酸化異丙醇100μL溶解結晶，于490nm波長處用用酶標儀檢測吸光度(A)值。計算細胞生長抑制率。生長抑制率%= ［1－（A實驗組－A空白對照組）/（A陰性對照組－A空白對照組）］%。

1.2.2檢測細胞分化及凋亡取1000000個細胞，預冷的PBS洗兩次（2000r/5min），然后加入 10μL的AnnexinV 緩沖液用于懸浮細胞后再分別加入5μLAnnexinⅤ-FITC，5μLPI-PE，混勻，于遮光處放置15min，再加AnnexinV 緩沖液500μL，2000r/min，離心5 min。用FACSCalibur流式細胞儀檢測SHI-1細胞的分化與凋亡。

1.2.3檢測WT1和hDMP1藥物處理后細胞中表達的變化各組細胞培養后24，48 ，72h后收集1×106個SHI-1細胞。按RNA提取試說明書操作提取總RNA，在紫外分光光度儀中定量；RNA反轉錄合成cDNA， 逆轉錄體系20μL，其中總RNA 2μg。GAPDH、hDMP1PCR反應體系為：總體積為25μl，cDNA2μL，10×buffer 2.5μL，25 mmol/LMgCl2 2 .5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL， 5u/μLTaq酶0.25μL，100μmol/L引物探針各0.1μL，加雙蒸水補足反應總體積為25 L 。反應條件為： 95℃ 5 min熱啟動，然后95℃ 10 s變性。58℃ 15 s退火延伸，40個循環，58℃延伸時采集熒光信號。WT1的反應體系為：總體積為25μl，cDNA2μL，10×buffer 2.5μL，25 mmol/LMgCl21 .5μL，10mmol/L dNTP 0.5μL，5u/μLTaq酶0.5μL，100μmol/L引物探針各0.1μL，反應總體積為25 L 。反應條件為： 50℃ 3min預變性，95℃ 5 min熱啟動。然后95℃ 20 s變性。60℃ 60 s退火延伸，40個循環，60℃延伸時采集熒光信號。

1.3統計學分析各實驗數據以x±s表示，采用SPSS16.0軟件進行隨機化區組設計和單因素方差分析。以P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為具有非常顯著性差異。

2結果

2.1 SV單獨或聯合PMA處理 SHI-1細胞的抑制率變化協方差分析MTT結果顯示15μmol/LSV和10μmol/LSV單獨處理SHI-1細胞，隨著辛伐他汀培養濃度增加，培養時間延長，細胞抑制率逐漸增加（F=24.61，P=0.000）。15μmol/LSV聯合PMA處理SHI-1細胞72h后細胞抑制率（83.2±5.1%）較單用15μmol/LSV（63.9±4.7， P=0.000）和PMA（35.4±3.1%，P=0.000）明顯升高。提示了辛伐他汀以時間和劑量依賴方式抑制SHI-1細胞的增殖，且與PMA聯用具有協同抑制增殖的作用，其中以15μmol/LSV的聯合抑制作用最強(見表1)。

2.2辛伐他汀聯合PMA處理SHI-1后的細胞凋亡率變化流式檢測不同濃度辛伐他汀單獨或聯合PMA處理SHI-1細胞的AnnexinV/propidium iodide的結果顯示了隨著辛伐他汀濃度增加，培養時間延長，細胞的凋亡率逐漸增大（F=5.69，P=0.018），PMA處理SHI-1細胞培養24，48，72hAnnexinV表達水平與對照組比較差異無統計學意義（F=0.80，P=0.474），提示PMA無促進SHI-1細胞凋亡作用。15μmol/L辛伐他汀聯合PMA處理SHI-1細胞培養72hAnnexinV表達水平（28.43±1.34%）明顯較PMA（4.34±1.07%， P=0.000）和15μmol/L SV單藥處理明顯升高（15.59±0.95%，P=0.000），提示辛伐他汀可以協同PMA促進SHI-1細胞凋亡作用（見圖1）。

圖 1辛伐他汀單用或聯合PMA處理SHI-1細胞的早期凋亡率變化

2.3辛伐他汀處理后SHI-1細胞中WT1和hDMP1基因表達水平變化實時定量RT-PCR檢測SHI-1細胞中WT1和hDMP1表達水平的結果顯示：隨著辛伐他汀濃度增加，培養時間延長，WT1表達水平反而下降（F=12.20，P=0.008），反之， h DMP1表達水平逐漸升高（F=23.81，P=0.000）。15μmol/LSV聯合PMA處理SHI-1細胞培養48h WT1N(WT1*104/ GAPDH)表達水平（0.74±0.06）較單用SV（4.28±0.38，P=0.020）和PMA（1.39±0.12，P=0.036）具有統計學差異，即SV與PMA具有協同降低SHI-1細胞WT1表達；15μmol/LSV聯合PMA處理SHI-1細胞培養72 h hDMP1N(h DMP1*104/ GAPDH)（648.1±26.0） 表達較15SV（65.04±3.58，P=0.003）和PMA（34.55±1.35，P=0.005）單藥處理明顯升高，兩藥具有明顯協同作用，提示15μmol/LSV聯合PMA具有共同促進SHI-1細胞凋亡過程中WT1基因表達下降和h DMP1表達增加（見表2）。

注：SV辛伐他汀，WT1N表達水平以WT1*104/ GAPDH表示，h DMP1N表達水平以h DMP1*104/ GAPDH

3討論

SHI-1細胞株具有特征性t ( 6；11)表型異常，表達MLL/AF6 融合基因，并伴有p53基因缺失，成為白血病研究的一個新的有價值的工具。通過比較他汀對ATRA抵抗的HL-60-R2細胞株和HL-60的細胞株，報道了他汀類藥物對HL-60-R2的細胞殺傷作用比ATRA敏感的HL-60細胞株強2倍，在實驗所用的他汀類藥物中，辛伐他汀的致細胞凋亡作用最強，其作用機制與細胞內活性氧類物質（reactive oxygen species，ROS）的蓄積，線粒體損傷，胞外細胞色素c的釋放引起線粒體凋亡通路的活化有關[11]。曾經有報道認為他汀類藥物可以增加ATRA抵抗的NB4.300/6細胞株對ATRA的敏感性 [9]。本實驗結果發現辛伐他汀以時間和劑量依賴方式抑制SHI-1細胞的增殖，促進細胞分化與凋亡，其中以15μmol/LSV作用最強；且與PMA聯用具有協同抑制增殖和促進凋亡作用；研究結果提示了辛伐他汀具有殺傷單核細胞白血病細胞作用，與文獻報道相符合。

hDMP1對于P19ARF -P53凋亡通路的作用是正向調控，因此，被認為具有抑制腫瘤的增殖作用[7]。WT1基因作為腫瘤抑制基因或者癌基因存在，但最近的報道認為WT1無論是在兒童還是承認急性髓系白血病中，OS或者EFS都較無WT1突變組的差[12， 13]。也有文獻報道在ATRA和PMA誘導急性白血病細胞株分化之后，WT1表達降低了70%~90%，同時伴隨有h DMP1表達增加了1.9~7.4倍[8]。由于SHI-1細胞中WT1基因基礎表達水平較低，前期研究結果提示其表達水平明顯低于K562和NB4細胞[14]，本實驗中在辛伐他汀聯合PMA處理SHI-1細胞培養72h后WT1基因小于最低檢出限(在48h的時候降低了97%)，因此表2中未顯示相應數據，而hDMP1表達增加了12.99倍，提示辛伐他汀促進SHI-1細胞分化過程中，WT1基因表達水平下降伴隨著hDMP1表達增加。由于SHI-1細胞伴有p53基因缺失，推測辛伐他汀誘導SHI-1白血病細胞凋亡通過其他凋亡途徑實現，而非通過下調WT1癌基因表達，上調h DMP1基因表達從而激活P19ARF -P53凋亡通路而實現。

綜上所述，辛伐他汀可以抑制SHI-1細胞增殖，促進分化與凋亡，同時可以協同PMA抑制SHI-1細胞增殖，促進凋亡，為辛伐他汀協同治療AML提供理論依據，但尚需進一步探討其抗白血病效應機制。

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