功能化磁性納米粒子增強電化學發光檢測的研究

張艷林，牛玉生

（1.廣東環境保護工程職業學院　環境監測系，廣東　佛山　528216；2.青島大學，山東　青島　266071）

功能化磁性納米粒子增強電化學發光檢測的研究

張艷林1，牛玉生2

（1.廣東環境保護工程職業學院環境監測系，廣東佛山528216；2.青島大學，山東青島266071）

摘要：考察了五種不同功能化磁性納米粒子對?/TPA體系電化學發光（ECL）強度的影響，并對其中能顯著增強?ECL強度的磁性納米粒子的使用條件進行了初步的優化。通過電化學發光檢測技術發現BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe四種磁性粒子可增強/TPA體系的ECL強度，增強幅度依次為30%、13%、73%、42%；COOH-MNPs磁性粒子可淬滅該體系的ECL強度，淬滅幅度為23.2%。實驗結果表明，濃度為7μg/mL的PAA-Fe磁性納米粒子經磁鐵富集，在電極上富集5min是其促進ECL強度增強的最優條件。本研究對基于功能化磁性納米粒子開發新的電化學發光試劑和建立新的電化學發光體系具有重要意義。

關鍵詞：電化學發光；磁性納米粒子；電化學發光試

1　引言

電化學發光（Electrochem icaluminescence，ECL）技術由于具有背景噪音低，靈敏度高、所用儀器簡單、易精確控制和自動化等優點，已經成為分析科學中一種重要而有價值的研究方法［1]。磁性微納米材料作為一種新型的功能材料，因特殊的磁導向性、超順磁性，其表面可連接生物活性功能基團等特點，其與ECL技術聯用，可以增強電化學發光強度和靈敏度，為ECL技術研究開辟了一個廣闊的空間，如磁性納米材料結合ECL技術已實現了炭疽孢子、血小板衍生生長因子β鏈二聚體和Ramos腫瘤細胞的檢測［2-4]。近年來，發展新的電化學發光試劑和建立新的電化學發光體系，已成為電化學發光研究的熱點，本文以BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe和COOH-MNPs五種不同功能化磁性納米粒子為研究對象，尋找一種能顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優功能化磁性納米粒子，以期降低電化學發光檢測中被檢測物的最低檢測限，為電化學發光廣泛應用于物質檢測提供參考。

2　實驗部分

2.1儀器、試劑及供試材料

CHI800電化學工作站；MPI-A型毛細管電泳電化學發光檢測儀（西安邁瑞分析儀器有限公司），檢測池采用特制的毛細管電泳電化學發光檢測池。

分析純Ru（bpy）3Cl2·6H2O、三丙胺（TPA）（美國Sigma-Aldrich公司）。支持電解質為100mmol/LNa2HPO4-NaH2PO4溶液（pH=7.4），配制溶液所用水均經Milli-Q超純水系統（美國Millipore公司）純化。

供試功能化磁性納米材料主要包括：（1）BG-Fe：BPEI保護Graphene（石墨烯）+COOH-Fe3O4（30nm）；（2）BPG-Fe：BPEI保護Graphene+聚苯胺+COOH-Fe3O4（30nm）；（3）PAA-Fe：PAA-Graphene+Fe3O4；（4）PE-Fe：BPEI-Graphene+Fe3O4；（5）COOH-MNPs。其中BPEI為聚乙烯亞胺，PAA為聚丙烯酸。

空白液和對比液的配制：空白液含10μMu（bpy）2+3、1mMTPA、100mMPBS溶液；對比液分別為含有5μg/mL（磁微球聚合物中Fe3O4的濃度）的5種不同的功能化磁性納米粒子。

2.2實驗步驟

2.2.1電極制備

工作電極采用特制磁鐵可拆卸的金電極，使用前需經砂紙小心打磨，然后依次用1.0和0.3μm粒徑的氧化鋁粉末打磨，直至呈光滑鏡面后超聲清洗。

參比電極為3cm長的銀絲，一端焊接銅絲作為導線。用砂紙擦拭銀絲部分后浸入到3M硝酸溶液中去除銀絲表面的氧化層。5分鐘后取出，沖洗晾干后置于0.1MHCl溶液中電鍍（室溫，電流為20μA，電鍍時間24h）。等銀絲表面均勻覆蓋上一層黑灰色的AgCl層后，把制備好的Ag/AgCl參比電極插入到一個充滿飽和KCl溶液的玻璃管中，玻璃管底部用一根直徑為100μm的鉑絲穿孔便于電子傳遞。

三電極體系的對電極采用一段長度約為4cm的鉑絲。

2.2.2磁性材料預處理

將制備好的各種磁性納米材料經離心富集。取1mL磁性材料，加1mL乙醇后離心（5000rpm，5min）重復5次，再用超純水離心清洗5次，以去除其中的各種聚合物及未轉化的FeCl3，最后上清液在磁鐵吸附條件下去除。

2.2.3測定方法

金電極每次在使用前分別用1μm和0.3μm三氧化二鋁粉拋光，在二次水中充分超聲洗滌后，然后在0.1M的H2SO4溶液中用CHI800電化學分析儀在-0.2V-1.6V的電位區間內循環掃描，直到三個金電極特征峰顯現并電流穩定，取出電極后用二次水清洗和氮氣吹干。在磁鐵吸附電極的情況下，分別對空白液以及對比液進行循環伏安法掃描和檢測ECL強度。測試參數為：放大級數為3倍，光電倍增管電壓為800V，采樣時間：10T/S。

2.2.4條件優化

2.2.4.1磁極方向的影響

取5μg/mL可顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優功能化磁性納米粒子在空白液中經磁鐵正反兩面富集后，觀察磁性納米粒子的發光情況。

2.2.4.2富集時間的影響

取5μg/mL可顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優功能化磁性納米粒子在空白液中經電極依次富集5min、20min、30min后，

觀察磁性納米粒子ECL強度的變化情況。

2.2.4.3磁微球濃度的影響

檢測可顯著增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的最優功能化磁性納米粒子在1、2、5、7、10μg/mL不同濃度下的ECL強度。

3　實驗結果

3.1最優功能化磁性納米粒子的篩選

圖1　不同功能化的磁性納米粒子對Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的增強和淬滅情況

（圖A、B、C、D、E依次為BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe和COOH-MNPs五種磁性粒子對Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的影響情況，黑色曲線是空白液的ECL強度；紅色曲線是含不同功能化磁性粒子的對比液的ECL強度）

不同功能化的磁性納米粒子對Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度的增強和淬滅情況見圖1。其中BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe四種磁性粒子能增強Ru（bpy）2+3/TPA體系ECL強度，增強幅度依次為30%、13%、73%、42%；COOH-MNPs磁性粒子可淬滅該體系ECL強度，淬滅幅度為23.2%。考慮到BG-Fe、BPG-Fe、PE-Fe磁性粒子增強的幅度較PAA-Fe的幅度弱，且前三者磁性納米粒子由于外面具有聚合物聚乙烯亞胺，而聚乙烯亞胺本身就能夠增強ECL強度，因此不能充分說明是否單純是BG-Fe、BPG-Fe、PE-Fe磁性粒子的作用。綜上考慮，本文認為PAA-Fe是較理想的、能顯著增強ECL強度的磁性納米粒子，并進一步對PAA-Fe磁性納米粒子的使用條件進行了優化。

3.2磁極方向的影響

圖2　PAA-Fe功能化磁性納米粒子經磁鐵正、負面富集后的發光情況

（紅色是磁鐵正面、藍色是磁鐵負面、黑色是空白）

5μg/mL的PAA-Fe功能化磁性納米粒子經磁鐵正、負面下富集后磁性納米粒子的發光情況見圖2，由圖看出不同的富集面PAA-Fe功能化磁性納米粒子增強ECL強度的幅度不同，可能是由于正反面與磁鐵的南北極沒有統一下來，而后續的驗證是在磁鐵負面富集的情況下進行。

3.3富集時間的影響

圖3　PAA-Fe功能化磁性納米粒子不同的富集時間對ECL強度的影響

（紅色：5min；藍色：20min；綠色：30min；黑色：空白）

5μg/ml的PAA-Fe功能化磁性納米粒子在電極上不同的富集時間對ECL強度的影響見圖3，由圖可看出隨著富集時間的延長，PAA-Fe功能化磁性納米粒子促進ECL強度增強的幅度有所減弱，但所有富集時間的試驗組的ECL強度均比空白組的高。

3.4磁微球濃度的影響

圖4　不同PAA-Fe功能化磁性納米粒子濃度對ECL強度的影響

不同PAA-Fe功能化磁性納米粒子濃度對ECL強度的影響見圖4，由圖可看出不同濃度MNPS對ECL強度的影響不大，其中濃度在7μg/mL時ECL強度最強。

4　討論

鑒于新型功能化磁性納米材料為電化學發光研究帶來的新機遇，本研究以BG-Fe、BPG-Fe、PAA-Fe、PE-Fe和COOH-MNPs五種不同功能化磁性納米粒子為研究對象，通過電化學發光檢測技術篩選出能夠顯著增強ECL的MNPs，本文研究結果表明，PAA-Fe是五種新型功能化磁性納米供試材料中最理想的增強ECL的磁性納米粒子，可能是由于PAA-Fe粒徑在幾十納米尺寸范圍內，比表面積比較大，增大了發光試劑的結合量；加之其表面石墨烯材料既降低了磁性納米粒子的表面活性，抑制了氧化和團聚的現象，同時也增強了電化學發光反應在磁性材料表面的電子船體，因此進一步增強了Ru（bpy）2+3/TPA體系的ECL強度［5-6]。

另外，PAA-Fe功能化磁性納米粒子具有超順磁性，分離方便迅速，背景干擾較小，反應都是在液相中進行，信號均勻準確，下一步以PAA-Fe功能化磁性納米粒子作為磁分離的固相載體，結合電化學發光檢測技術，探討如何在免疫分析、DNA檢測等實際分析應用中降低檢測靶標的最低檢測限具有更重要的應用價值［7]。

參考文獻：

［1]Fahnr i ch K.A.，Pravda M.，Gui l baul t G.G.，Recent app l i cat ions of el ect rogenerated chemi l uminescence in chemical analysis［J]．Talanta，2001，54：531-539．

［2]John G．Bruno，Johnathan L．Kiel．In vit ro selection of DNA aptamers to anthrax spores with elect rochemiluminescnce detection［J]．Biosensors and Bioelect ronics，2010，26：285-288．

［3]Zhu D．B．，Zhou X．M．，Xing D． A new kind of aptamerbased immunomagnet ic elect rochemi luminescence assay for quant i tat i ve de tec t ion of p rotein［J]．Biosensor s and Bioelect ronics，2010，26：285-288．

［4]Ding C．，Ge Y．，Zhang S．S．，Elect rochemi ca l and elect rochemi luminescence determination of cancer cel ls based on aptamers and magnetic beads［J]．Chem．Eur．J．，2010，16：10707-10714．

［5]Lu A H，Salabas E L，Schuth F．Magnetic nanopar ticles：synthesis，protection，functional ization and appl ication［J]．Angewandte Chemie-Internat ional Edi t ion，2007，46（8）：1222-1244．

［6]謝鋼，張秋禹，李鐵虎．磁性高分子微球［J]．高分子通報，2001，12：38- 43．

［7]王偉，吳堯，顧忠偉．磁性納米粒子的表面改性及其在生物醫學領域的應用［J]．中國材料進展，2009，28（1）：43-47．

作者簡介：張艷林（1980—），女，山東聊城人，碩士研究生，實驗師，主要從事環境監測方向教學和科學研究。

The Study on Electrochemiluminesence Detection Enhanced byFunctional Magnetic Nanoparticles

ZHANG Yan-lin1，Niu Yusheng2
（1.Guangdong Vocational Co llege of Environm en tal Pro tection Eng ineering，Foshan 528216，China；2.Qingdao Un iversity，Qingdao 266071，Ch ina）

Abst ract：Herein，the effect of f ve different magnetic nanoparticles（MNPs）on electrochemiluminesence（ECL）intensity of the Ru（bpy）2+3/TPA system were conducted.preliminarily operating conditions of the ideal MNPs were optim ized．The result indicated that BG-Fe，BPG-Fe，PAA-Fe and PE-Fe could enhance ECL intensity in the Ru（bpy）2+3/TPA system by method of ECL detection，and the enhanced amplitude of ECL intensity was 30%，13%，73% and 42%，respectively.COOH-MNPs could quench the ECL intensity and the amplitude was 23.2%.The utmost ECL enhancement of Ru（bpy）2+3/TPA system was obtained in the optimum conditions as follows：PAA-Fe concentration of was at 7μg/m l and accumulation for 5 minutes by the magnet.The study is of important signif cance for development of new ECL reagents and establishment of ECL system based on MNPs.

Keywords：Electrochem icaluminescence；Magnetic nanoparticles ；ECL reagents