酶法制備貝類寡肽生產技術研究

李永青 趙祥忠 張合亮

LI Yong－qing 1 ZH AO Xiang－zhong 2 ZHANG He－liang 2

姜雙雙1 楊曉宙

JIANG Shuang－shuang 1 YANG Xiao－zhou 1

（1.國家海產貝類工程技術研究中心，山東 威海 264200；2.齊魯工業大學，山東 濟南 250353）

（1.National Marine Shellfish Engineering Technology Research Center，Weihai，Shandong 264200，China；2.Qilu University of Technology，Jinan，Shandong 250353，China）

中國每年貝類的產量在1 200萬t左右，其加工下腳料占貝肉總量的25%以上［1］。目前，貝類下腳料除小部分被用作食品加工外，大部分用于飼料生產，資源浪費嚴重。這些貝類加工下腳料主要由貝類裙邊、性腺和內臟團等組成，營養豐富，蛋白質含量高，氨基酸組成比例合理，活性成分含量也較多，可用于生產功能性的貝類寡肽產品［2］。目前，貝類下腳料的研究主要以生產貝類蛋白質粉和氨基酸為主，如汪濤等［3，4］研究了扇貝邊的酶解技術，并利用貝類廢棄物制造了水解動物蛋白；遲玉森等［5］研究了扇貝裙邊酶解中溫度對氨基氮的影響和抑臭工藝的確定；紀蓓等［6］研究了扇貝邊酶法水解工藝的優化；李愛芬等［7］研究了扇貝邊蛋白資源酶法水解條件的優化；于利君等［8］研究了羅非魚蛋白制備寡肽酶解條件的優化；張文芬等［9］研究了鳙魚肉可溶性蛋白酶解條件優化；徐律等［10］選用胰蛋白酶將菲律賓蛤仔酶解制備了具有抗前列腺癌PC－3細胞的寡肽。但未見利用扇貝邊和鮑魚邊制備貝類寡肽的研究報道。諾維信堿性蛋白酶是一種高效堿性內切蛋白酶，能快速徹底水解各種蛋白質，尤其適合于水產下腳料、酵母精等行業的蛋白水解過程。而諾維信風味蛋白酶可以有效去除蛋白鏈上的疏水基團，能最大限度的避免蛋白水解過程中苦味肽的產生，適合水解產物用于食品或食品配料時使用。本研究擬以貝類下腳料為原料，選用酶法制備分子量在1～10 k D的貝類寡肽，以期為貝類寡肽的工業化生產提供有力的理論支持和技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

貝類裙邊（扇貝邊、鮑魚邊）：威海長青海洋科技股份有限公司；

乙醇、甲醛：分析純，天津市富宇精細化工有限公司；

氫氧化鈉、硼酸：分析純，天津市博迪化工有限公司；

硫酸：分析純，深圳市多源化工有限公司；

硫酸鉀：分析純，天津市致遠化學試劑有限公司

堿性蛋白酶（alcalase 2.4 L FG）：5萬 U／g，諾維信公司；

風味蛋白酶（novozyme flavourzyme）：1萬 U／g，諾維信公司；

超微粉碎機：WK－10型，山東省青州市精誠醫藥裝備制造有限公司；

真空冷凍升華干燥機：LGJ－0.5型，上海昨非實驗室設備有限公司；

超濾膜過濾機：UF－500L／H型，無錫市超濾膜設備廠；

納濾過濾機：NF1812型，無錫市超濾膜設備廠；

噴霧干燥機：SP－1500型，上海達程實驗設備有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 測定方法

（1）蛋白質：凱氏定氮法。

（2）游離氨基酸：甲醛滴定法。

（3）貝類寡肽含量：首先用凱氏定氮法測定酶解前溶液中蛋白質的百分含量，再用甲醛滴定法測定酶解液中游離氨基酸的百分含量，則溶液中貝類寡肽的百分含量：

式中：

m——貝類寡肽的百分含量，%；

M——酶解前溶液中蛋白質的百分含量，%；

M1——酶解液中游離氨基酸的百分含量，%。

（4）貝類寡肽得率：首先用凱氏定氮法測定酶解前溶液中蛋白質的百分含量，再用甲醛滴定法測定酶解液中游離氨基酸的百分含量，則溶液中貝類寡肽的得率：

式中：

R——貝類寡肽得率，%；

M——酶解前溶液中蛋白質的百分含量，%；

M1——酶解液中游離氨基酸的百分含量，%。

1.2.2 貝類寡肽生產工藝

1.2.3 前處理工藝對酶解效果的影響 稱取重量相等的3份貝類裙邊，分別采用組織搗碎機打漿處理、凍干后粉碎處理和熱風烘干后直接粉碎處理，各配制成10 g／100 m L的溶液，調整p H為8.0，各加入300 U／g的堿性蛋白酶，在55℃下酶解60 min，然后測定貝類寡肽的得率，并用300目濾網過濾酶解液，觀察過濾效果。

1.2.4 復合酶協同酶解工藝條件優化 選用諾維信堿性蛋白酶和風味蛋白酶進行貝類裙邊的酶解試驗，通過測定貝類寡肽得率確定最佳用酶。進行底物濃度、加酶量、p H值、酶解溫度和酶解時間單因素試驗，通過正交試驗優化酶解工藝和參數。

（1）蛋白酶種類的確定：分別進行單一酶酶解和協同酶解（復合添加量1∶1）試驗。單一酶解：分別配制12 g／100 m L的貝類裙邊溶液，添加堿性蛋白酶的一組調節p H至8.0（添加風味蛋白酶的一組調節p H 為7.0），加入500 U／g的堿性蛋白酶（風味蛋白酶），控制55℃酶解60 min，測定貝類寡肽含量；協同酶解操作條件同上，需注意調節p H為7.5，復合酶添加量500 U／g（堿性蛋白酶∶風味蛋白酶＝1∶1），最后測定貝類寡肽含量。

（2）貝類裙邊溶液濃度對寡肽含量的影響：分別配制6，8，10，12，14，16 g／100 m L的貝類裙邊溶液，用0.5 mol／L的NaOH溶液調節p H值至7.5，加入500 U／g的復合酶，控溫55℃酶解60 min，測定貝類寡肽含量。

（3）加酶量對貝類寡肽得率的影響：分別在12 g／100 m L的貝類裙邊溶液中加入200，300，400，500，600，700，800 U／g的復合酶，調整p H 為7.5，控溫55℃酶解60 min，測定貝類寡肽含量。

（4）p H值對貝類寡肽得率的影響：用0.1 mo L／L的鹽酸溶液和NaOH溶液調整濃度為12 g／100 m L貝類裙邊溶液的p H 分別為 6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，分別加入500 U／g的復合酶，控溫55℃酶解60 min，測定貝類寡肽含量。

（5）酶解溫度對貝類寡肽得率的影響：配制12 g／100 m L的 貝類 裙 邊 溶液，調 節 p H 至7.5，加 入500 U／g的復合酶，分別控制酶解溫度為45，50，55，60，65℃，酶解60 min，測定貝類寡肽含量。

（6）酶解時間對貝類寡肽得率的影響：配制12 g／100 m L的貝邊粉溶液，調p H至7.5，加入500 U／g的酶，控溫55℃，酶解時間分別為30，40，50，60，70，80 min，測定貝類寡肽含量。

1.2.5 貝類寡肽純化的研究 酶解后的溶液中含有未降解的大分子蛋白質、多肽、寡肽、氨基酸和水等，為提高寡肽產品的純度，分別采用微濾、超濾聯用技術除去酶解液中的蛋白質、多肽、氨基酸和水，收集1～10 kD的濾液，噴霧干燥后得到粉末狀貝類寡肽產品。

試驗中首先選用陶瓷微濾膜（200 nm）對酶解液過濾，除去大分子的蛋白質，過濾條件為溫度30℃，過濾壓力0.05 MPa；濾過液再分別經截留分子量為50，10，1 k D的聚砜超 濾 膜 依 次 過 濾，超 濾 膜 壓 力 依 次 為 0.05，0.10，0.15 MPa。其中，50 k D的超濾膜可以將小分子的蛋白和部分多肽分離出去，同時減輕10 kD超濾膜的壓力，1 k D的聚砜膜除去的是絕大部分氨基酸和水分，收集10 k D與1 kD之間的濾液。

過濾后的酶解液先經過微濾再進行分級超濾處理，截取中間截濾液，然后噴霧干燥制備貝類寡肽產品。

2 結果與討論

2.1 前處理工藝對酶解效果的影響

由表1可知，凍干粉碎后貝類裙邊的酶解徹底，寡肽得率高，比打漿法寡肽得率多2.06%，提高了91.1%，熱風烘干后粉碎次之，這是因為貝類裙邊尤其是貝類裙邊的組織結構非常致密，常規的高速組織搗碎機和熱風干燥后粉碎難以將貝類裙邊打成均勻的細漿狀，由于打漿處理后的貝類下腳料組織大小不勻，導致較大的裙邊組織在酶解過程中難以水解，而細小的組織卻會因酶解時間的延長導致寡肽進一步降解為游離氨基酸。

表1 前處理工藝對酶解效率的影響Table 1 The influence of different treatment on enzymatic hydrolysis efficiency

真空冷凍干燥的凍結過程中在貝類肌肉細胞和組織之間可形成許多細小的冰晶，這些冰晶在升華階段可直接汽化，在貝肉組織中形成許多氣孔，使貝肉組織容易粉碎，粉碎后的顆粒也變得蓬松，溶解速度快，酶解效果好；貝類裙邊凍干后水分含量可以降低到5%左右，此時貝類裙邊的韌性由于水分較低而消失，脆性增強，適宜于粉碎處理。

因此，貝類裙邊酶解前采用真空冷凍干燥后再粉碎處理，有利于酶解的進行，可有效提高酶解效率。

2.2 復合酶協同酶解工藝條件優化

2.2.1 蛋白酶種類的確定 由表2可知，堿性蛋白酶的酶解效果最好，寡肽得率最高，酶解液苦味較重；風味蛋白酶的酶解效果一般，酶解液中苦味最不明顯；堿性蛋白酶和風味蛋白酶按1∶1的比例協同酶解效果較好，寡肽得率也較高，而且酶解液的苦味也明顯減輕。考慮到貝類寡肽產品的食用適口性問題，因此，確定最佳降解用酶為堿性蛋白酶和風味蛋白酶協同使用，兩者復合使用比例為1∶1。

2.2.2 貝類裙邊溶液濃度對寡肽得率的影響 由圖1可知，隨貝類裙邊溶液濃度的不斷增加，貝類寡肽得率逐漸提高，當濃度接近12 g／100 m L時，上升趨勢趨于平緩，繼續增加溶液濃度，寡肽得率稍微出現下降趨勢。這說明當下腳料溶液濃度超過最適底物濃度后，酶濃度相對變稀，而且過多的裙邊會限制酶的運動，降低了酶解反應。因此，將12 g／100 m L作為最佳貝類裙邊溶液濃度。

圖1 酶解反應中底物濃度對貝類寡肽得率的影響Figure 1 The effect of the concentration of substance on shellfish oligopeptide yield

2.2.3 加酶量對貝類寡肽得率的影響 由圖2可知，隨加酶量的不斷增加，貝類寡肽得率逐漸提高，當濃度接近500 U／g時，寡肽得率接近最高值，繼續增加酶量，寡肽得率反而出現下降趨勢。這是因為超過最佳酶用量后，過量的酶會將寡肽進一步降解為氨基酸，導致溶液中寡肽含量降低。因此，確定500 U／g作為貝類裙邊最佳加酶量。

圖2 加酶量對貝類寡肽得率的影響Figure 2 The effect of enzyme concentration on shellfish oligopeptide yield

表2 不同蛋白酶酶解貝類裙邊效果Table 2 Enzymatic hydrolysis of shellfish skirt by different protease

2.2.4 p H值對貝類寡肽得率的影響 由圖3可知，p H值對貝類寡肽得率的影響較大，寡肽得率先隨p H值的增大逐漸升高，p H值7.5時接近最高值，p H值繼續增大，寡肽得率反而下降。這是因為每種酶制劑都有其最適的酸堿環境，低于或高于其最適p H，酶活性都會迅速降低。因此，確定貝類裙邊酶解最佳p H為7.5。

圖3 酶解反應p H值對貝類寡肽得率的影響Figure 3 The effect of p H on shellfish oligopeptide yield

2.2.5 酶解溫度對貝類寡肽得率的影響 由圖4可知，復合蛋白酶在55℃的條件下酶解反應最好，寡肽得率最高，說明此條件時酶活力最大，較低和較高的溫度都不利于酶解反應的進行，超過最適溫度后復合酶活力失活比較迅速。因此確定復合蛋白酶酶解貝類裙邊的最適宜溫度為55℃。

圖4 酶解溫度對貝類寡肽的影響Figure 4 The effect of temperature on shellfish oligopeptide yield

圖5 酶解時間對貝類寡肽得率的影響Figure 5 The effect of time on shellfish oligopeptide yield

2.2.6 酶解時間對貝類寡肽得率的影響 由圖5可知，酶解時間對貝類寡肽得率的影響較大，寡肽得率先隨酶解時間的延長逐漸升高，60 min時接近最高值，繼續延長酶解時間，寡肽得率反而有所下降。這是由于過度酶解會導致部分貝類寡肽進一步降解為氨基酸，因此，確定貝類裙邊最佳酶解時間為60 min。

2.3 正交試驗確定最佳酶解工藝

綜合以上5個因素的分析，選取對貝類寡肽得率影響較大的加酶量、酶解p H、酶解溫度和酶解時間進行L9（34）正交試驗，結果見表3、4。

表3 正交試驗因素水平表Table 3 The factors and levels graph of experiment

表4 正交試驗結果與分析Table 4 The statistic analysis of orthogonal experiment

由表4可知，四因素對寡肽得率影響的順序是A＞C＞B＞D，最佳組合為 A2B2C3D2。由于試驗組中沒有A2B2C3D2組合，因此以A2B2C3D2、A2B2C3D3和A2B2C2D23組進行驗證實驗（n＝3），結果A2B2C2D2組的寡肽得率最高，達到8.43%，因此，確定最佳的酶解條件為：堿性蛋白酶與風味蛋白酶按1∶1的比例復合使用，添加量500 U／g，貝類裙邊溶液濃度12 g／100 m L，p H值7.5，酶解溫度55℃，酶解時間60 min，此時貝類寡肽得率為8.43%。

2.4 貝類寡肽產品的純化

試驗過程中采用不同的微濾膜、超濾膜等純化處理方式，酶解液中截留分子量、蛋白質、游離氨基酸和貝類寡肽含量見表5。

表5 不同膜純化對酶解液中各成分的影響Table 5 The effect of different membrane on purification of enzymolysis liquid components

收集分子量在1～10 kD的濾液并噴霧干燥，噴霧干燥條件進風溫度170.0℃、熱空氣流量35.0 m3／h、壓縮空氣流量480.0 L／h、出風溫度75～80℃，得到顏色微黃的粉末狀貝類寡肽產品，并測得貝類寡肽得率為5.16%，其蛋白質含量為94.6%，寡肽含量86.8%。

3 結論

在貝類裙邊水解過程中，貝邊經真空冷凍干燥后粉碎處理，有助于酶解反應的進行；諾維信中性蛋白酶和風味蛋白酶按1∶1的比例復合后協同作用既可以快速降解貝類蛋白質，又能有效降低酶解液的苦味，通過單因素試驗和正交試驗得出了貝邊最佳酶解參數為：復合酶添加量500 U／g，貝類裙邊溶液濃度12 g／100 m L，p H值7.5，酶解溫度55℃，酶解時間60 min；酶解液經過濾和噴霧干燥后制得了粉末狀的貝類寡肽產品。

本試驗未對制得的分子量在1～10 kD的貝類寡肽的功效進行研究，以期后續研究。

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