超聲對荔枝汁中TAB的殺菌效果研究

黃 瑞 余小林 胡卓炎 江杏心

HUANG Rui YU Xiao－lin HU Zuo－yan JIANG Xing－xin

楊澤嘉 紀麗純

YANG Ze－jiaJI Li－chun

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

（College of Food Science South China Agricultural University，Guangzhou，Guangdong 510642，China）

酸土脂環芽孢桿菌（Alicyclobacillus acidoterrestris）屬革蘭氏陽性芽孢桿菌，具有嗜酸、耐熱的特點。它是造成巴氏滅菌果汁（p H 2.5～5.5）腐敗的主要原因之一［1］，其引起的腐敗特征是產生具有特殊氣味的愈創木酚、鹵酚等酚類代謝物而嚴重影響果汁的風味和口感，有時可導致果汁的濁度升高甚至在產品底部形成白色沉淀［2］，由此給生產企業帶來巨大的經濟損失，并給消費者的健康安全帶來隱患。2000年起，國際貿易中嚴格要求每10 m L濃縮果汁中其含量小于1個，美國及歐洲大部分國家從2002年起要求在濃縮果汁中不得檢出酸土脂環芽孢桿菌。目前，國內外針對蘋果汁、橙汁、橘汁等溫帶果蔬汁及混合果蔬汁中酸土脂環芽孢桿菌的研究有較多報道［3，4］，而針對荔枝汁、芒果汁、木瓜汁等亞熱帶果汁中酸土脂環芽孢桿菌的殺菌研究很少。荔枝是嶺南特色水果，荔枝汁是除荔枝干外的最大加工產品，濃縮荔枝汁主要用于出口，對提高荔枝的經濟價值有很大作用。荔枝汁的成分體系適合酸土脂環芽孢桿菌生長，該菌有存在于荔枝汁中的可能性。然而，傳統的巴氏殺菌方法不僅有可能使酸土脂環芽孢桿菌殘存，而且還會使荔枝汁等亞熱帶果汁加熱后的風味、顏色等品質變劣，況且酸土脂環芽孢桿菌能夠耐受高溫，瞬時高溫滅菌過程不能致死［5］，這使亞熱帶果汁的生產有可能面臨新的問題，與蘋果汁等其它果汁一樣，成為中國果汁拓展國內外市場的風險因素之一。

超聲殺菌作為一種冷殺菌方式，近年在果蔬加工中的應用研究有較多報道［6－8］。超聲具有的空化作用能夠在極短的時間內殺滅和破壞微生物，該作用在液體中產生的局部瞬間高溫及溫度交替變化、局部瞬間高壓和壓力變化，使液體中某些細菌致死、病毒失活，甚至使體積較小的某些微生物的細胞壁破壞［7］；由于超聲處理不需要加熱，因而可保持果汁等食品原有滋味和風味［8］。然而超聲波對酸土脂環芽孢桿菌的殺菌效果目前尚未見報道，因此本研究以荔枝汁為原料，人為將酸土脂環芽孢桿菌添加于荔枝汁中，探討在荔枝汁的物質成分體系下，不同超聲處理對酸土脂環芽孢桿菌的殺滅效果，同時比較超聲殺菌和水浴加熱殺菌對荔枝汁品質的影響。旨在為超聲技術在果蔬汁中的應用提供依據，同時進一步深入對酸土脂環芽孢桿菌的研究。

1 材料及方法

1.1 材料及處理

荔枝汁的制備：品種為懷枝，市售。將新鮮荔枝清洗干凈后去皮、去核、榨汁、過濾；取過濾后荔枝汁50 m L，加入菌液濃度為105～106CFU／m L的酸土脂環芽孢桿菌菌懸液，然后進行超聲殺菌處理；

酸土脂環芽孢桿菌：取自廣東省微生物菌種保藏中心，將其接種于BAM培養基、活化后于4℃保存；

BAM培養基：按美國模式培養物集存庫（American type culture collection）標準配置。

1.2 試驗儀器

超聲波細胞破碎機：SCIENTZ－ⅡD型，寧波新芝生物科技有限公司；

超凈工作臺：SW－CJ－1FD型，蘇州安泰空氣技術有限公司；

溫度梯度恒溫箱：MTI－201B型，日本Eyela公司；

手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋：SYQ－DSX－280B型，上海申安醫療器械廠；

生物顯微鏡：XSP－16A型，江南光學儀器廠；

雙層恒溫振蕩器：ZWY－A2102C型，上海智城分析儀器制造有限公司；

色差計：CM－3500d型，日本美能達公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK－SD型，上海一恒科技有限公司。

1.3 試驗設計

1.3.1 超聲殺菌試驗設計

（1）單因素試驗：超聲功率的單因素試驗分別取0，100，200，300，400，500，600 W，固定超聲時間為5 min、超聲間歇時間為5 s；超聲時間的單因素試驗分別取0，1，3，5，7，9，11，13，15 min，固定超聲功率為400 W、超聲間歇時間為5 s；超聲間歇時間的單因素試驗分別取1，3，5，7，9 s，固定超聲功率為400 W、超聲時間為5 min；果汁p H的單因素試驗分別用檸檬酸將果汁p H 調節為3.5，3.7，3.9，4.1，4.3以及未調節原液，固定超聲時間5 min、超聲功率400 W、超聲間隔時間5 s。以各單因素條件處理荔枝汁，考察不同超聲處理因素對荔枝汁中酸土脂環芽孢桿菌殺菌效果的影響。

（2）響應面試驗：在單因素試驗的基礎上，采用Design Expert 8.05試驗設計軟件，利用響應面方法（RSM）中Box－Behnken設計（BBD），進行超聲處理的條件優化。

1.3.2 水浴加熱殺菌 取按1.1制備的荔枝汁50 m L置于滅菌后玻璃瓶中，在90℃水浴中加熱滅菌10 min。

1.4 分析方法

1.4.1 酸土脂環芽孢桿菌數目測定 將各處理前后的荔枝汁1 m L稀釋梯度后，涂布于BAM瓊脂平板培養基，在50℃恒溫培養48 h、計數；根據處理前后的酸土脂環芽孢桿菌數目，按式（1）計算酸土脂環芽孢桿菌殺菌率。

式中：

W——酸土脂環芽孢桿菌殺菌率，%；

C——超聲處理后的酸土脂環芽孢桿菌數，CFU／m L；

C0——超聲處理前的酸土脂環芽孢桿菌數，CFU／m L。

1.4.2 果汁品質指標的測定 Vc按照 GB 6195－1986（2，6－二氯靛酚滴定法）進行測定；總酸按照GB／T 12456－2008（酸堿滴定法）進行測定；總糖和還原糖按照參考文獻［9］的方法測定；色差值的測定取各處理荔枝汁10 m L于專用的測色皿中，用色差儀測定△E，L，a，b。

1.4.3 數據處理與分析 以上各指標測定均為3平行，分別取其平均值，并采用 Excel 2010 和 SPSS（statistical product and service solutions）對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗的結果

超聲處理單因素條件對荔枝汁酸土脂環芽孢桿菌的殺菌效果見圖1。由圖1（a）可知，隨著超聲功率的升高，殺菌率先上升后略有下降，在400 W處達到最大值為89.17%，在600 W處為79.83%。這是因為一定范圍內增加超聲功率，可促進空化作用，并使空化導致的一定熱效應、空化機械作用增強，從而增強殺菌效果；而超過該范圍時，功率過大反而使空化泡不易產生，故表現為殺菌效果不隨之增加，周麗珍等［10］對超聲殺菌研究也有類似結果，因此，其余單因素試驗均采用400 W的超聲功率。

由圖1（b）可知，隨著超聲時間的增加，殺菌率呈上升趨勢，超聲時間為9 min時殺菌率為91.62%，15 min時殺菌率為96.78%，兩者之間的殺菌率差異為5.16%。雖然超聲作用時間對微生物致死有一定差異，但超聲15 min的殺菌率僅比9 min提高了5.63%，考慮到長時間超聲處理會使果汁升溫，對果汁中熱敏性成分產生影響，對機器的損耗也較大，故選取超聲處理時間為9 min進行其余試驗。

超聲間隔時間反映的是超聲連續工作的時間，由圖1（c）可知，改變超聲間隔時間，對殺菌率的影響表現為先略有上升后略有下降的趨勢，變化范圍在75.07%～85.07%；在間隔時間5 s處出現轉折點，此時的殺菌率達到最小值為85.07%。

由圖1（d）可知，未調節p H的原液經超聲處理后的殺菌率為87.07%，除p H 3.7條件下殺菌率比未調節小外，其余各p H調節條件下的殺菌率均比原液大。

圖1 不同超聲條件對荔枝汁酸土脂環芽孢桿菌的殺菌效果Figure 1 Sterilizing effect of different ultrasound conditions on Alicyclobacillus acidoterrestris in Litchi Juice

利用SPSS軟件分別對超聲條件進行AVOAN分析，結果為：超聲時間對殺菌效果影響極顯著（P＜0.01），超聲功率和超聲間隔時間對殺菌效果影響顯著（P＜0.05），果汁p H對殺菌效果影響不顯著。

2.2 超聲處理響應面試驗結果

2.2.1 回歸模型的建立及顯著性檢驗 根據單因素試驗結果，以超聲功率、超聲間歇時間、超聲時間為自變量，以殺菌率為響應值，進行響應面試驗。因素水平設計見表1，試驗結果見表2，方差分析見表3。

根據表2結果，利用Design Expert 8.05軟件對所得數據進行回歸分析，得到多元二次回歸模型：

表1 Box－Behnken試驗設計因素及水平Table 1 Factors and levels of Box－Benhnken lest

由表3可知，一次項X2影響極其顯著，X1、X3影響顯著，表明超聲時間、超聲功率、超聲間隔時間均對殺菌率的線性效應顯著；二次項X1影響極其顯著，X2影響高度顯著，X3影響顯著，交互項X2X3影響顯著。回歸方程的相關系數R2＝0.987 1，P值為0.000 3，回歸方程模型達到顯著水平，且失擬項不顯著，說明該模型與實際情況擬合度良好。同時，由F值大小可以判斷，在所選擇的因素范圍內，各因素對結果的影響排序為超聲時間＞超聲功率＞超聲間隔時間。

表2 Box－Behnken設計試驗結果Table 2 Box－Behnken experimental design arrangement and responses

2.2.2 響應曲面分析 由圖2可知，隨著超聲功率、超聲時間、超聲間隔時間的增加，殺菌率逐漸上升；但繼續增加超聲功率、超聲時間、超聲間隔時間，殺菌率開始下降。綜合分析可知，超聲功率與超聲時間、超聲時間與超聲間隔時間交互作用顯著，超聲功率與超聲間隔時間交互作用不顯著，且在超聲功率360～410 W、超聲時間6.8～8.3 min、超聲間隔時間4.5～5.3 s范圍內具有最大響應值。

表3 回歸與方差分析結果Table 3 Results of regression and variance analysis

表3 回歸與方差分析結果Table 3 Results of regression and variance analysis

＊＊＊差異極其顯著，P＜0.001；＊＊差異高度顯著，P＜0.01；＊差異顯著，P＜0.05。R 2＝0.987 1，R＝0.963 7，信噪比＝17.535。

方差來源 平方和 自由度 均方 F值 P 顯著性模型 389.15 9 43.24 42.36 0.000 3 ＊＊＊X1 12.78 1 12.78 12.52 0.016 6 ＊X2 168.91 1 168.91 165.46＜0.000 1 ＊＊＊X3 12.43 1 12.43 12.17 0.017 5 ＊X1 X2 3.69 1 3.69 3.61 0.115 8 X1 X3 0.016 1 0.016 0.015 0.906 4 X2 X3 7.78 1 7.78 7.63 0.039 8 ＊X 12 149.69 1 149.69 146.63＜0.000 1 ＊＊＊X 22 37.80 1 37.80 37.03 0.001 7 ＊＊X32 14.95 1 14.95 14.64 0.012 3 ＊殘差項 5.10 5 1.02失擬項 3.92 3 1.31 2.20 0.327 8純誤差 1.19 2 0.59總誤差 394.26 14

2.2.3 最優條件的確定及驗證實驗 根據Design Expert 8.05軟件分析，得出超聲殺滅荔枝汁中酸土脂環芽孢桿菌的最佳處理條件為：超聲功率385 W、超聲時間7.69 min、超聲間隔時間4.89 s，在此條件下模型預測的最大殺菌率為92.16%。考慮到實際操作情況，將此最佳殺菌條件修正為超聲功率400 W、超聲時間7.5 min、超聲間隔時間5 s，進行驗證實驗，共3次，測得該條件下酸土脂環芽孢桿菌的殺菌率的平均值為92.25%，與模型預測值的誤差為0.466%，表明模型與實測的吻合度良好，說明采用響應面法優化得到的條件參數準確可靠，得到的回歸方程具有一定的實際意義。

2.3 超聲處理對荔枝汁品質的影響

為考察超聲處理對荔枝汁營養成分的影響，選取同一批荔枝汁，按上述殺菌方法，測定了在優化條件處理前后荔枝汁的Vc、總酸、總糖、還原糖以及色差值，并與90℃水浴加熱殺菌進行比較，結果見表4。由表4可知，加熱殺菌的殺菌率為90.66%，超聲殺菌的殺菌率為92.25%，即超聲殺菌效果優于加熱殺菌。超聲波殺菌后荔枝汁Vc、總酸、總糖、還原糖的降低程度均小于加熱殺菌，色差值△E，b的變化也小于加熱殺菌，視覺上可觀察到加熱殺菌后荔枝汁色澤變暗程度遠遠大于超聲殺菌。超聲殺菌主要是利用超聲波的空化作用，對熱敏強的Vc損失較小，而加熱殺菌由于溫度升高促進了Vc的分解。結果表明超聲殺菌能有效地保持荔枝汁的營養品質和果汁原有色澤。

圖2 不同因素兩兩交互作用對殺菌效果影響的響應曲面分析Figure 2 Response surface analysis of significant effective interacti on items of ultrasonic power，ultrasonic treatment time and ultrasonic intermittent time on sterilization

表4 不同殺菌方式處理的荔枝汁各品質指標Table 4 Different sterilization methods on quality indicators in litchi juice

3 結論

（1）通過響應曲面分析得到超聲殺滅荔枝汁中酸土脂環芽孢桿菌的最佳處理條件為：超聲功率400W、超聲間隔時間5 s、超聲時間7.5 min；在該條件下，酸土脂環芽孢桿菌的殺菌率為92.25%。

（2）超聲殺菌對荔枝汁Vc、糖酸以及色澤的影響程度小于加熱殺菌。

（3）在最佳超聲條件下，酸土脂環芽孢桿菌殺菌率92.25%仍無法達到果汁國際貿易的要求（＜1個／10 m L），需要進一步研究超聲與其他殺菌方式的聯用。

1 王梅，焦必寧，薛楊.果汁中脂環酸芽孢桿菌研究進展［J］.食品與發酵工業，2009，35（1）：96.

2 Baumgart J，Menje S.The impact of Alicyclobacillus acidoterrstris on the quality of juices and soft drinks［J］.Fruit Processing，2000，10（7）：251～254.

3 王軍堂.濃縮蘋果汁生產過程中嗜酸耐熱菌的控制技術［D］.陜西：西北農林科技大學，2011.

4 王梅.橙汁與柑橘園中脂環酸芽抱桿菌的分離鑒定與檢測研究［D］.重慶：西南大學，2010.

5 Chang S，Kang D.Alicyclobacillus spp.in the fruit juice：history，characteristics，and current isolation ＆ detection procedures［J］.Critical Review in Microbiology，2004，30（2）：55～74.

6 郭麗娟，丘泰球，范曉丹.超聲波協同臭氧處理對梨汁菌落總數的影響［J］.食品研究與開發，2007，28（2）：1～3.

7 栗星，包海蓉.超聲波在食品殺菌中的研究現狀［J］.農產品加工業，2008（6）：25～28.

8 鄭瑞生，王則金.食品冷殺菌技術的研究綜述［J］.河南工業大學學報，2011，32（3）：85.

9 李雪梅，楊俊慧，張利群，等.還原糖測定方法的比較［J］.山東科學，2008，21（2）：18～20.

10 周麗珍，李冰，李琳，等.超聲非熱處理因素對細菌殺菌效果的影響［J］.食品科學，2006，27（12）：54～57.