三維適形調(diào)強放療治療新疆骨棘球蚴病大鼠后T淋巴細胞亞群的變化及意義

姚瑞祥，徐萬龍

(1.烏魯木齊市第一人民醫(yī)院外二科，新疆 烏魯木齊 830000；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨一科，新疆 烏魯木齊 830000)

·論著·

三維適形調(diào)強放療治療新疆骨棘球蚴病大鼠后T淋巴細胞亞群的變化及意義

姚瑞祥1，徐萬龍2

(1.烏魯木齊市第一人民醫(yī)院外二科，新疆 烏魯木齊 830000；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院骨一科，新疆 烏魯木齊 830000)

目的通過觀察三維適形調(diào)強放療(Intensity modulated radiation therapy，IMRT)對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴進行治療后大鼠T淋巴細胞亞群的影響，探討IMRT對骨包蟲的殺滅機制是否與射線激發(fā)宿主對骨包蟲有效的免疫反應有關(guān)。方法選取股骨繼發(fā)性棘球蚴病大鼠50只，隨機分為IMRT組及空白對照組各25只，以IMRT方式分別對IMRT組25只大鼠左側(cè)股骨棘球蚴病區(qū)給予40 Gy劑量的放療，于放療1周后所有大鼠活殺取材，取脾制備細胞懸液,用流式細胞術(shù)(FCM)檢測CD4+/CD8+的值。結(jié)果IMRT作用1周后，流式細胞儀檢測結(jié)果提示，IMRT組大鼠脾淋巴細胞CD4+/CD8+的值(2.96±1.90)明顯高于空白對照組(1.65±1.31)，差異具有統(tǒng)計學意義(t=0.544，P＜0.05)。結(jié)論IMRT可促進新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴的凋亡，其作用機制可能是與射線激發(fā)宿主對骨包蟲有效的免疫反應有關(guān)。

IMRT；骨；包蟲；T淋巴細胞亞群

包蟲病(Hydatid disease)是指由細粒棘球絳蟲(Echinococcus granulosus，Eg)、多房棘球絳蟲(E.oligarthrus)、寡節(jié)棘球絳蟲(E.oligarthrus Diesing)和福氏棘球絳蟲(E.vogeli Rausch＆Bernstein)的幼蟲在人畜之間相互傳染的寄生蟲病，嚴重危害全球人類的健康。我國包蟲病的發(fā)病率很高[1]，尤其是地處邊疆的新疆[2]。骨包蟲在人體各臟器包蟲病的發(fā)病率位列第三，肝臟和肺臟的包蟲病發(fā)病率則位居前兩位。雖然骨包蟲病在全世界有較高的發(fā)病率，但是臨床上現(xiàn)有的藥物以及手術(shù)的治療方式對此病幾乎不能根治，臨床療效較差，而放射治療對骨包蟲具有很好的殺滅作用。為了檢測放射治療除了對骨包蟲除了直接殺滅作用外，是否還存在免疫殺滅作用，本研究通過對骨包蟲病大鼠病灶區(qū)實施IMRT，并取大鼠脾制備細胞懸液，用流式細胞術(shù)(FCM)檢測CD4+/CD8+的值，以期為臨床上將IMRT用于對骨包蟲的治療，提供實驗室證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物的選取及分組選用新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院實驗動物實驗室提供的股骨繼發(fā)性棘球蚴病成年雄性大鼠50只。隨機分為IMRT組及空白對照組各25只，所有骨包蟲大鼠均在CT、計算機輔助下精確勾畫放射靶區(qū)和制定放療計劃后，以IMRT方式分別對IMRT組25只大鼠左側(cè)股骨棘球蚴病區(qū)給予40 Gy劑量的放療。

1.2 方法將經(jīng)IMRT放射后的兩組大鼠活殺處死，將大鼠左股骨骨髓腔內(nèi)的骨包蟲的包囊在顯微鏡下取出，經(jīng)甲醛、戊二醛侵泡后低溫保存。將標本經(jīng)石蠟處理后切薄片，HE染色處理，在顯微鏡下觀察。剩余部分標本經(jīng)戊二醛、鋨酸處理，脫水后切薄片，在電子顯微鏡下觀察。通過光鏡及電鏡對接受放療后骨棘球蚴包囊細胞形態(tài)學的觀察以了解IMRT對骨包蟲的殺滅效果。同時于顯微鏡下取脾臟，無菌鹽水沖洗后碾碎，過篩后離心，溶解紅細胞，離心后調(diào)整細胞濃度至1×107ml/L，加入抗體后流式細胞儀于488 nm波長下測定細胞綠色熒光，并檢測T淋巴細胞亞群CD4+、CD8+細胞的比值，以觀察放療對大鼠主免疫功能所產(chǎn)生的影響。

1.3 統(tǒng)計學方法應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。所測得的大鼠脾淋巴細胞CD4+/CD8+的值以均數(shù)±標準差±s)表示，兩組之間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IMRT對骨包蟲的殺滅效果經(jīng)放射后的骨包蟲囊壁可見大量的變性壞死，生發(fā)細胞大量減少，細胞板層結(jié)構(gòu)受損，出現(xiàn)層列，間隙間可見空泡樣改變，甚至一些細胞直接出現(xiàn)崩裂樣狀態(tài)，無法分辨正常的細胞形態(tài)。電子顯微鏡下可見：所有正常細胞形態(tài)消失，細胞胞質(zhì)排列疏散，線粒體變粗腫脹，線粒體內(nèi)嵴擁擠、斷開，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒樣改變，疏松，細胞核崩裂、固縮，可見凋亡小體，見圖1。

圖1 IMRT放療后骨棘球蚴包囊細胞(電鏡×8 000)

2.2 IMRT對大鼠主免疫功能所產(chǎn)生影響IMRT作用1周后流式細胞儀檢測結(jié)果提示，IMRT組大鼠脾淋巴細胞CD4+/CD8+的值為(2.96±1.90)，較空白對照組大鼠脾淋巴細胞CD4+/CD8+的值(1.65±1.31)有明顯升高，且差異具有統(tǒng)計學意義(t=0.544，P＜0.05)。

3 討論

自1996年美國紐約的MemorialSloan-Kettering Cancer Center首先發(fā)表文章闡述適形調(diào)強放射治療技術(shù)至今，IMRT已有15年的發(fā)展歷史。IMRT是通過計算機來控制射線的方向，將精確的、劑量高的射線集中在我們所關(guān)心的病變組織區(qū)域，而周圍組織很少受到射線的損傷，所以IMRT是現(xiàn)有臨床上一種可靠的、精度高的放射治療方法，受到學者的推崇。由于IMRT對腫瘤細胞有很高的殺滅作用，筆者認為IMRT對骨包蟲的細胞也應該有很好的殺滅作用。本研究對骨包蟲病實施IMRT，通過光鏡、電鏡對接受放療后骨棘球蚴包囊細胞形態(tài)學的觀察，可以看到IMRT射線集中，局部高能殺滅骨包蟲，而且放射線可將深藏于松質(zhì)骨、骨小梁中間的骨包蟲頭節(jié)清除徹底，降低骨包蟲殘留率、復發(fā)率。

本實驗證明了IMRT對殺滅骨棘球蚴病具有很好的效果，放射線對骨包蟲除了具有直接殺滅作用外，是否還存在免疫殺滅作用呢？部分學者認為IMRT應有一定的殺滅骨包蟲的作用，且其機制可能與射線激發(fā)宿主對骨包蟲有效的免疫反應有關(guān)[2-7]。

本研究通過流式細胞儀檢測激活的CD4+/CD8+的T細胞比值變化，以此探討IMRT對骨細粒棘球蚴感染大鼠所致宿主免疫功能變化的影響。T細胞的分類，按T細胞的分化群(Cluster of differentiation，CD)以及在機體內(nèi)免疫應答所發(fā)揮的作用不一樣，將其分為CD4+(TH/TDTH)以及CD8+(TS/TC)等不同的細胞亞群。CD4+T細胞具有輔助和誘導功能，CD8+T細胞具有抑制和細胞毒性功能，各功能亞群之間是相互聯(lián)系、相互促進、相互制約的。CD4+/CD8+的比值可以間接提示集體的免疫水平、免疫功能的調(diào)節(jié)控制狀態(tài)，如果比值降低則間接提示免疫狀態(tài)的抑制，反之則意味著免疫狀態(tài)的增強。

本研究通過對骨包蟲病大鼠病灶區(qū)實施IMRT，并取脾制備細胞懸液，用流式細胞術(shù)(FCM)檢測CD4+/CD8+的值，以期為探討IMRT促進新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴的凋亡機制是否與射線激發(fā)宿主對骨包蟲有效的免疫反應有關(guān)。本研究結(jié)果提示IMRT作用1周后，流式細胞儀檢測到IMRT組大鼠脾淋巴細胞CD4+/CD8+的值明顯高于空白對照組，差異具有統(tǒng)計學意義。提示IMRT可通過刺激大鼠淋巴細胞亞群的CD4+細胞增多為主形成保護性免疫，從免疫機制方面限制了骨包蟲在機體內(nèi)進一步繁殖、擴增的可能，可以增加宿主防御、控制骨包蟲的增長。本實驗初步證實IMRT對新疆大鼠繼發(fā)性骨棘球蚴病的殺滅機制可能是與射線激發(fā)宿主對骨包蟲有效的免疫反應有關(guān)，但具體的通路及信號轉(zhuǎn)導過程需要進一步探索。

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Significance of T lymphocyte subsets in rats with echinococcosis in Xinjiang after intensity modulated radiation therapy.

YAO Rui-xiang1,XU Wan-long2.
1.The Second Department of Surgery,the First People's Hospital of Urumqi,

Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA;2.The First Department of Orthopedic,People's Hospital of Xinjiang Uygur Autonomous Region,Urumqi 830011,Xinjiang,CHINA

ObjectiveTo observe the change and significance of T lymphocyte subsets in rats of Xinjiang with echinococcosis after intensity modulated radiation therapy(IMRT),and explore the possible mechanism.MethodsFifty cases of rats with secondary echinococcosis at femurs were selected and randomized into two groups equally.25 rats in IMRT group were given IMRT at the left femur,where the echinococcosis located，with a total irradiation doses of 40 Gy.And one week after radiation,the spleen cells were collected from all rats.The value of CD4+/ CD8+was detected by flow cytometry.ResultsOne week after IMRT,the value of CD4+/CD8+in the IMPT group (2.96±1.90)was significantly higher than that in the blank control group(1.65±1.31).ConclusionIMRT contributes to the therapy of secondary echinococcosis，with a underlying mechanism of activation in effective parasite-host immune response which is initiated by radiation.

Intensity modulated radiation therapy;Bone;Echinococcosis;T lymphocyte subsets

R-332

A

1003—6350（2014）17—2497—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.17.0979

2014-03-24)

國家自然科學基金項目（編號：81360276)；新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目-青年博士科技人才培養(yǎng)項目（編號：2013731013)；新疆維吾爾自治區(qū)科技支疆項目（編號：201391129)；新疆維吾爾自治區(qū)自然科學基金項目（編號：2012211B34)

徐萬龍。E-mail：xuwanlong20082008@163.com