水貂肺炎雙球菌的分離與鑒定

秦緒偉 禚寶山 （齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

水貂肺炎雙球菌的分離與鑒定

秦緒偉 禚寶山 （齊魯動(dòng)物保健品有限公司 山東 濟(jì)南 250100）

本試驗(yàn)從諸城一水貂廠發(fā)病水貂分離到一株細(xì)菌，經(jīng)解剖、細(xì)菌分離、鏡檢、生化試驗(yàn)確診為肺炎雙球菌，經(jīng)藥敏試驗(yàn)采取綜合治療方案，最終控制了病情。

水貂 雙球菌 肺炎 鑒定

肺炎球菌又稱肺炎雙球菌，屬于革蘭氏陽(yáng)性球菌中鏈球菌屬[1]，在自然界中分布廣泛，可引起各種動(dòng)物的大葉性肺炎或者腦膜炎，亦可致幼獸肺炎或者敗血癥[2]。臨床上很少會(huì)見(jiàn)到急性發(fā)病案例，多種健康動(dòng)物的呼吸道可以分離到肺炎雙球菌，一般不作為致病菌，只有條件惡劣機(jī)體抵抗力差的時(shí)候才會(huì)發(fā)病。此次水貂養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生急性死亡、口鼻流血的病例，經(jīng)診斷確診為肺炎雙球菌病。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 來(lái)自于山東諸城一水貂養(yǎng)殖場(chǎng)，養(yǎng)殖水貂3000只，咳嗽、口鼻出血，發(fā)病水貂經(jīng)解剖無(wú)菌條件分離肺臟、氣管，獲得一株細(xì)菌。

1.1.2 其他材料 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS瓊脂、麥康凱瓊脂等購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；微量生化試劑管購(gòu)自北京路橋技術(shù)有限責(zé)任公司；藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑公司；其他實(shí)驗(yàn)室常規(guī)試劑。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鏡檢 無(wú)菌條件下取水貂的肺臟，切開(kāi)后在血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂涂抹，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，將分離菌接種于血清營(yíng)養(yǎng)瓊脂、鮮血平板、麥康凱瓊脂、SS瓊脂，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h觀察生長(zhǎng)情況。取血清平板上典型的菌落，進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡鏡檢。

1.2.2 細(xì)菌的生化試驗(yàn) 將分離菌接種于加血清的馬丁肉湯培養(yǎng)基37℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)24h，取培養(yǎng)液0.2ml接種于乳糖、葡萄糖、麥芽糖、菊糖、棉實(shí)糖、海藻糖、梨醇、甘露醇、觸酶試驗(yàn)、七葉苷、膽鹽等微量生化反應(yīng)管，培養(yǎng)24h記錄各種生化管的反應(yīng)情況。

1.2.3 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定 16S rRNA：無(wú)菌挑取平板上的菌落加入到1ml無(wú)菌水中，震蕩混勻后沸水浴7min，冰浴5min，離心上清作為基因擴(kuò)增的模板，設(shè)計(jì)引物：F1-5’AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’，R1-5’ACG GCT ACC TTG TTG TTA CGA CTT-3’，PCR反應(yīng)體系(50ul)：10*PCR Buffer(含MgCl215mmol/L，KCl500 mmol/L)5ul，2.5mmol/L dNTP 4ul,引物(20umol/L)各1ul，模板2ul，ddH2O36.8ul，Taq酶(5U/ul)0.25ul。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 30s，72℃ 1.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min。取PCR產(chǎn)物5ul用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物送交上海基因測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果提交Genbank進(jìn)行比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，判定細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育地位，以97%相似性為界限判定為何種菌。

1.2.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn) 無(wú)菌取血清平板上的典型菌落，在平板上均勻涂抹，將標(biāo)準(zhǔn)化的藥敏片貼在平板上，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，使用直尺測(cè)量抑菌圈的直徑，觀察細(xì)菌對(duì)各種藥敏片的敏感程度。

1.2.5 細(xì)菌的毒力試驗(yàn) 在無(wú)菌條件下使用接種環(huán)挑取單個(gè)菌落，接種于馬丁肉湯培養(yǎng)基，37℃恒溫?fù)u床震蕩培養(yǎng)24h，100倍稀釋后腹腔注射小白鼠，0.3ml/只共計(jì)5只，連對(duì)照組2只一起飼養(yǎng)，注射后觀察7日。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)與鏡檢結(jié)果

分離菌在血清平板上生長(zhǎng)為密集的細(xì)小的露珠樣透明菌落，鮮血平板可見(jiàn)灰白色細(xì)小菌落呈現(xiàn)明顯的溶血環(huán)，麥康凱瓊脂、SS瓊脂不生長(zhǎng)。在顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)菌較純，呈現(xiàn)革蘭氏陽(yáng)性球菌，細(xì)菌呈矛頭狀，多兩兩成對(duì)，也有的連接成4個(gè)或者雙排。

2.2 細(xì)菌的生化結(jié)果

取0.2ml細(xì)菌液體培養(yǎng)液接種于微量生化反應(yīng)管，可見(jiàn)細(xì)菌分解乳糖、葡萄糖、麥芽糖、菊糖、棉實(shí)糖、海藻糖，不分解山梨醇、甘露醇，觸酶試驗(yàn)陰性，七葉苷陽(yáng)性，膽鹽溶解陽(yáng)性。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 分離菌生化鑒定結(jié)果

2.3 細(xì)菌的分子生物學(xué)鑒定結(jié)果

根據(jù)上海測(cè)序公司的測(cè)序結(jié)果，采用Bioedit軟件參照正反向序列圖譜對(duì)序列進(jìn)行校對(duì)，然后輸入Genbank用Blastn軟件進(jìn)行相似性比較，最后利用構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，與肺炎鏈球菌相似性為99.9%，最終確定為肺炎鏈球菌。

2.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

使用藥敏紙片法測(cè)量分離菌對(duì)各種藥物的敏感性，可見(jiàn)頭孢喹肟、頭孢哌酮、頭孢噻呋、阿莫西林、青霉素高敏，萬(wàn)古霉素、強(qiáng)力霉素、阿米卡星、安普霉素、替米考星中度敏感，左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、氟苯尼考低度敏感，林可霉素、復(fù)方新諾明、粘桿菌素不敏感。具體藥敏結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 分離菌的藥敏直徑 (mm)

2.5 毒力試驗(yàn)結(jié)果

100倍稀釋后的細(xì)菌培養(yǎng)液注射5只小白鼠第3天全部死亡，對(duì)照組觀察7日，全部健活。死亡小白鼠心血分離到革蘭氏陽(yáng)性雙球菌。該雙球菌有較強(qiáng)的毒力。

3 討論

3.1 肺炎雙球菌的分離鑒定

此次水貂發(fā)病為激素水貂，天氣比較熱，正值換毛期間，換毛引起的機(jī)體抵抗力差，呼吸道的正常菌群大量繁殖成為致病菌，造成了大量的死亡，主要癥狀急性死亡、死亡水貂營(yíng)養(yǎng)狀況良好、口鼻有的出血，解剖可見(jiàn)肺部嚴(yán)重出血腫大、氣管環(huán)內(nèi)大量血沫，之前按照綠膿桿菌引起的出血性肺炎投服氟苯尼考3d未見(jiàn)明顯改善。

3.2 肺炎雙球菌的癥狀

水貂感染肺炎雙球菌主要癥狀為大群精神、食欲正常，發(fā)病的水貂急性死亡，有的幾分鐘，有的幾個(gè)小時(shí)，突然發(fā)病，有的突然尖叫口鼻流血死亡，病程長(zhǎng)的可見(jiàn)精神沉郁、不吃食，逐漸后肢癱瘓、弓背、呻吟，步態(tài)蹣跚或者地上打滾，最后呼吸急促，全身癱軟死亡。剖檢可見(jiàn)肺臟腫大出血呈現(xiàn)黑色，氣管內(nèi)有大量的血液或者血樣泡沫，有的肝臟、腎臟出血。

3.3 肺炎雙球菌的診斷

多種細(xì)菌都可以感染水貂引起肺炎，呈現(xiàn)比較嚴(yán)重的急性死亡、口鼻流血、肺臟腫大出血的比較常見(jiàn)的是綠膿桿菌，另外還有巴氏桿菌、克雷伯氏菌、侵肺型大腸桿菌、肺炎雙球菌等，這幾種細(xì)菌引起癥狀基本相同，但是治療和傳染性不同，因此需要細(xì)菌分離鑒別診斷。肺炎雙球菌在顯微鏡下直接涂片鏡檢見(jiàn)革蘭氏陽(yáng)性雙球菌即可診斷，其他細(xì)菌鏡檢都為陰性，及時(shí)診斷有助于選擇對(duì)癥的藥物，及時(shí)控制疾病。綠膿桿菌細(xì)菌分離可見(jiàn)平板綠色菌落，大腸桿菌在麥康凱培養(yǎng)基呈現(xiàn)紅色，巴氏桿菌在鏡檢下可見(jiàn)兩極濃染的小桿菌、麥康凱和SS培養(yǎng)基不生長(zhǎng)，克雷伯氏菌呈現(xiàn)粘稠的拉絲菌落，這些特征在實(shí)驗(yàn)室條件下通過(guò)簡(jiǎn)單的檢測(cè)都可以區(qū)別于肺炎雙球菌。

3.4 肺炎雙球菌的防制

肺炎雙球菌現(xiàn)在沒(méi)有有效的疫苗進(jìn)行防疫，只能從飼料、環(huán)境衛(wèi)生方面進(jìn)行控制，不要飼喂變質(zhì)的飼料，疑似變質(zhì)飼料全部熟制，發(fā)病后及時(shí)診斷，及時(shí)采用敏感性高的藥物進(jìn)行治療。本次病例，發(fā)病后每天使用聚維酮碘全群帶動(dòng)物消毒，飼料全部熟制，第2天開(kāi)始投服敏感藥物阿莫西林，發(fā)病嚴(yán)重的注射頭孢噻呋，第3天死亡減少，第5天停止死亡，有效的控制了疫情。

[1] 周庭銀. 臨床微生物學(xué)診斷與圖解第2版[M]. 上海: 上海科學(xué)技術(shù)出版社, 2006, 97-98.

[2] 陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)第5版[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2013, 83-90.

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