鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定

馮永勝 衣服德 （山東省青島市畜牧獸醫研究所 266100）陳正平 （青島市嶗山區沙子口街道畜牧獸醫站）

鴨病毒性肝炎病毒的分離與鑒定

馮永勝 衣服德 （山東省青島市畜牧獸醫研究所 266100）陳正平 （青島市嶗山區沙子口街道畜牧獸醫站）

鴨病毒性肝炎(DVH)是由鴨肝炎病毒(DHV)引起雛鴨的一種以肝臟出血性炎癥為特征的急性烈性傳染病。該病在許多國家廣泛傳播，使養鴨業遭受重大損失。近年來，在許多地區時有發生，嚴重影響了養鴨業的發展。為了有效控制該病的發生和流行，筆者從患病鴨群中分離了DHV分離株，并進行了初步的鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料 DHVI型標準陽性血清購自中國獸醫藥品監察所；9～11日齡SPF雞胚購山東省家禽研究所；11～12日齡非免疫鴨胚購自濰坊某孵化場；4日齡雛鴨購自濰坊某種鴨場。

1.2 病料的采集 將DVH病鴨無菌采集肝臟。接種普通瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板，分別在37 ℃恒溫箱培養24h。觀察有無細菌生長。將病料研碎，與滅菌生理鹽水按照1:5混勻，然后加入終濃度為1000U/ml的青霉素和鏈霉素，于4℃冰箱中過夜。3000r/min離心10min，取上清液，-20℃保存備用。

1.3 病毒的分離與培養 將病料上清液經尿囊腔接種11～12日齡非免疫鴨胚各20只(0.2ml/枚)，于37.5℃溫箱內培養。棄去24h內死亡的鴨胚，以后每隔12h觀察1次，收集死亡鴨胚的尿囊液，觀察鴨胚病變。按同樣的方法，將病毒連續盲傳5代。

1.4 RT-PCR檢測 參照GenBank中發表的DHV VP1基因序列設計1對引物，引物由上海捷瑞公司合成。按照TRIzol試劑(Invitrogen公司)說明，用SDS-蛋白酶K法提取病毒RNA。反轉錄后，以反轉錄產物為模板進行PCR擴增。取10.0μl反應產物于10g/L瓊脂糖中進行電泳分析。

1.5 血清學特性觀察 取一定量的DHV分離株按1:2、1:20、1:200和1:2000倍稀釋，加入等體積的I型DHV標準陽性血清，并加入終濃度均為100 U/ml的青霉素和鏈霉素。于37℃溫箱作用60min后，接種11～12日齡鴨胚各10枚(0.2ml/只)。另取5枚鴨胚經尿囊腔接種0.1ml DHV病毒液作為陽性對照，另取5枚不接種作為空白對照。相同條件下培養，連續觀察7d。

1.6 毒力測定 將DHV分離株進行1:1×102、1:1×103、1:1×104、1:1×105、1:1×106稀釋，接種11～12日齡鴨胚各10枚(0.2ml/只)。同時設空白對照組。接種后，棄去24h內死亡的鴨胚，每天觀察鴨胚的死亡情況，連續觀察6d。按Reed-Muench法計算ELD50。

1.7 動物回歸試驗 選擇50只4日齡雛鴨，隨機分為5組，每組10只。將病料接種雛鴨，腿部肌肉注射，0.2 ml/只。對照組雛鴨注射相同劑量的生理鹽水。觀察并記錄雛鴨的臨床表現和死亡情況。

2 結果

2.1 病毒分離 病料接種在11～12日齡鴨胚傳5代后，基本穩定在48～96h胚胎死亡，死亡率可達90%以上（鴨胚傳代死亡情況見表1）。死亡鴨胚發育受阻，全身皮膚和皮下充血和出血，腹部和后肢嚴重水腫，肝呈黃紅色，腫大，并有針頭大小出血點和壞死灶。該病毒株對鴨胚ELD50按照毒力測定方法測定結果為105.33。

表1 DHV分離株各代次鴨胚不同死亡時間的死亡率

2.2 RT-PCR檢測結果 DVH病鴨肝臟中提取RNA，采用RT-PCR方法擴增出0.5kbp大小的片段，與預期大小一致。采用RT-PCR方法檢測鴨胚尿囊液中是否有禽呼腸孤病毒、禽淋巴細胞白血病病毒等，結果均為陰性。接種雞胚比正常雞胚小，孵至21日齡后仍不能出殼而出現死胚。所分離的病毒不能凝集雞紅細胞，判定為DHV單一感染。

2.3 分離病毒的血清學特性 將DHV分離株與I型DHV標準陽性血清孵育，接種鴨胚。中和試驗結果顯示，分離株1:2稀釋液被DHV陽性血清中和后，24～144h的鴨胚死亡率為100%，1:2000稀釋液被DHV陽性血清中和后，24～144h的鴨胚死亡率分別為80%，這株病毒與I型DHV陽性血清的交叉保護率為20%。

表2 I型DHV陽性血清對DHV分離株的交叉保護率

2.4 分離株對雛鴨的致病性 將分離株按照 0.2ml/只接種雛鴨，其對雛鴨的致死率為 30%～60%。雛鴨在接種后2～3d達到死亡高峰，表現為突然發病、不食，死亡快，發病鴨共濟失調，全身抽搐，臨死前雛鴨橫臥，雙腿呈劃水狀，出現背脖后仰現象，死亡時角弓反張，剖檢病變主要表現為肝臟出血等病毒性肝炎特征性病變。

3 小結

鴨傳染性肝炎是困擾養鴨業發展的主要傳染病之一，死亡率高達30%～90%。但是，近幾年來發現該病出現變異株或新型毒株，使病毒性肝炎連續不斷發生。這種發病規律與該研究對其病原學的研究結果一致。該分離的DHV毒株對鴨胚具有高致病性，均符合DHV的目前流行特點，分離株對鴨胚的致死率為30%～60%，與I型病毒性肝炎陽性血清幾乎不能提供交叉保護。該研究從發病鴨群中分離到的分離株，明確了病原，為開展該病的防制工作提供了科學依據。

S858.32

B

1007-1733(2014)06-0054-02

2014–03–28）