污泥負荷對生物處理系統耐藥細菌的影響研究
——以活性污泥法中磺胺嘧啶抗性異養菌為例

袁青彬,郭美婷*,楊 健

(1.同濟大學,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,上海200092；2.同濟大學環境科學與工程學院,上海200092)

污泥負荷對生物處理系統耐藥細菌的影響研究
——以活性污泥法中磺胺嘧啶抗性異養菌為例

袁青彬1,2,郭美婷1,2*,楊 健1,2

(1.同濟大學,污染控制與資源化研究國家重點實驗室,上海200092；2.同濟大學環境科學與工程學院,上海200092)

為了研究污水生物處理工藝中抗藥性細菌生長和分布特性及污泥負荷的影響,構建了不同處理負荷的活性污泥工藝,并以磺胺嘧啶抗性異養菌為例,闡述了污泥負荷對活性污泥系統中典型抗藥細菌的生長及排放特性的影響.結果表明,污泥負荷增大有利于磺胺嘧啶抗性異養菌的生長繁殖,負荷提高后凈比生長速率和細菌產量分別由0.32d-1和2.3×106CFU/d提高至0.33d-1和3.1×106CFU/d,活性污泥、出水和剩余污泥中抗藥菌的濃度也均顯著提高(P <0.05),但對抗藥細菌的相對豐度無顯著改變.低污泥負荷下[0.24kg COD/(kg MLSS?d)]抗藥細菌主要通過剩余污泥形式排放,排放量比(泥中排放量/水中排放量)為28.4;負荷提高至0.4kg COD/(kg MLSS?d)后,出水抗藥細菌排放量顯著提高,排放量比為1.1.處理相同水量,高污泥負荷下排放的抗藥細菌總量明顯降低,提高污泥負荷有利于活性污泥系統抗藥性風險的控制.

活性污泥法；污泥負荷；磺胺嘧啶抗性異養菌；生長；排放

隨著抗生素的過度使用,其對環境的影響和危害變得日益嚴峻,成為近些年研究的熱點之一.進入環境中的抗生素可能誘導環境中抗藥細菌及其抗藥基因的產生[1],而抗藥基因也作為一種“新型污染物”被提出,并開始受到重視[2].

污水廠作為各種含抗生素廢水的匯集地,含有多種抗藥細菌.迄今為止,已在許多國家污水廠中檢測到多種抗生素的抗藥細菌,其中較為普遍的抗藥細菌是大腸桿菌和腸球菌[3-5],抗藥基因有抗四環素基因(tetR),抗磺胺類基因(sulR)以及抗青霉素基因(mecA)等[6-8].由于進水水質和工藝條件的不同,各污水廠出水中抗藥細菌和抗藥基因濃度存在較大差異,檢測到抗藥細菌最高可達 104CFU/mL,抗 藥 基 因 濃 度 可 達105copies/mL.Huang等[9]調查了我國北京地區某污水廠中抗藥細菌存在水平,指出污水廠二級出水中對青霉素、氨芐青霉素、頭孢金素和氯霉素等抗生素耐受細菌的濃度約在103～105CFU/mL,占總異氧菌群的50%以上.這表明,我國也面臨污水抗生素抗性污染的問題,但抗性污染特征尚缺乏基礎數據,相關研究仍少見報道.

一些國家和地區針對污水處理工藝對抗藥細菌的去除效果已開展了初步的研究.奧地利某污水廠傳統活性污泥法對抗藥性大腸桿菌的去除率達1.5～2.5log[3];葡萄牙污水廠活性污泥法去除抗藥性腸球菌的能力在0.8～1.1log之間[4].不同國家及地區的污水廠對抗藥細菌去除效率不同,同一地區或同一工藝處理效果也不盡相同;但總體看來,處理水平在0.5～4.0log之間[10].除了研究污水處理工藝對抗藥細菌數量去除或減量效果,少數研究人員還關注了污水處理后抗藥細菌的抗藥性能.Da Costa等指出,污水處理使得耐環丙沙星的腸球菌的抗藥性較處理前增強,使抗藥細菌的環境風險進一步加大[4].這意味著污水廠不僅影響抗藥細菌數量或濃度,其引起的細菌抗藥性能的改變同樣值得關注.

污水廠運行條件,如處理工藝、水力停留時間、曝氣條件、水力負荷、污泥齡、回流比等,對細菌(包括耐藥細菌)的生長繁殖起到關鍵性的作用,因而可能對其中抗藥細菌的分布和去除特性產生影響.針對污水廠中的運行條件等對抗藥細菌分布特性的影響已有部分初步的研究.Munir等[11]研究了密歇根5座污水處理廠中不同處理工藝對耐藥細菌和耐藥基因去除的影響,發現 MBR工藝對四環素和磺胺嘧啶抗藥細菌的去除效果顯著優于傳統活性污泥法,同樣,好氧消化和石灰穩定等污泥處置的效果也顯著高于傳統的脫水和重力沉降等處置方法.Mezrioui和Baleux等[12]的調查表明好氧瀉湖對糞腸桿菌的去除率高于污水廠的活性污泥工藝,且瀉湖出水大腸桿菌耐藥率(35%)高于活性污泥工藝出水(23%).然而目前這方面的研究仍處于較初級的階段,對于污水廠中運行條件對抗藥細菌分布和去除的影響探討地仍不夠深入和全面,有必要針對特定的運行參數開展系統性的研究.

本研究以污泥負荷這一運行參數為例,通過實驗室構建活性污泥系統,從抗藥細菌的分布、生長和排放特性等方面系統考察污水中較為常見的磺胺嘧啶抗性異養菌的影響.

1 材料與方法

1.1 污水水樣

污水水樣取自上海市 Q污水廠沉砂池出水段,用25L滅菌聚乙烯塑料桶盛裝后15min內運送至實驗室進行實驗.

1.2 活性污泥系統

1.2.1 反應器設計 主體裝置為2個相同的圓柱形有機玻璃反應器(圖1),內徑14cm,高度26cm,有效容積3.85L,采用磁力攪拌器攪拌,增氧泵曝氣.系統以SBR的方式運行.

圖1 活性污泥系統示意Fig.1 Schematic diagram of the activated sludge system

1.2.2 反應器啟動及運行 反應器的接種污泥取自上海Q污水廠回流污泥,將污泥接種于2個反應器內,至反應器體積的1/3左右,再加入Q污水廠沉砂池出水至頂端刻度線.保持攪拌和曝氣并每天更換一次進水.定期監測反應器混合液污泥濃度(MLSS)和污泥沉降比(SV);當 MLSS>1000mg/L,SV在30 %左右后認為污泥馴化完畢.將兩反應器污泥混合液充分混合攪拌后均分至A、B兩個反應器中.

運行期間,兩反應器的運行周期均設置為8h,攪拌器轉速為100r/min,DO濃度保持在2～3mg/L,污泥齡均為8d,周期內進水、反應、沉淀、排水4個反應階段運行時間兩反應器保持一致且分別為2,448,25,5min,通過調節進水水力負荷,使得2個反應器的污泥負荷分別為0.24和0.4kg COD/(kg MLSS?d).按照上述反應條件運行5周,期間定期監測出水COD、濁度等指標,確保反應器處于穩定運行狀態.

1.3 取樣及水質分析

在反應器穩定運行5周后開始取樣,取樣點包括進水,2個反應器活性污泥混合液、出水以及剩余污泥,取樣量均為50mL.立即監測其污泥濃度(MLSS)、pH值、濁度、化學需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)、硝態氮(NO3--N)、總氮(TN) 總磷(TP)等指標,剩余水樣置于4℃保存以用于后續抗藥細菌的檢測.

pH值采用便攜式pH計(pH340i,WTW)測定;濁度采用便攜式濁度儀(2100P,HACH)測定;COD 采用COD快速測定儀(DR2800,HACH)測定;SS、NH4+-N、NO3--N、TN、TP和MLSS采用國標中規定的方法進行測定.

1.4 抗性異養菌檢測

采用細菌平板計數(標準)的方法檢測磺胺嘧啶抗性異養細菌的數目.向滅菌冷卻后的營養培養基(牛肉膏3g/L,蛋白胨10g/L,NaCl5g/L,瓊脂15g/L,pH7.2 ±0.2)中加入一定量的抗生素試劑,使培養基中的磺胺嘧啶濃度達到512mg/L.培養基中磺胺嘧啶的濃度根據 CLSI (2011版)[13]中規定的各種常見病原菌對磺胺嘧啶具有抗藥性的標準中最大值確定.分別取一系列濃度梯度稀釋后的水樣(或泥樣)1mL加至含有上述培養基的皮式培養皿中混合,待冷卻凝固后放入恒溫培養箱中37℃培養24h,統計菌落數在20～300CFU/mL的培養皿,確定磺胺嘧啶抗性異養細菌的數目.每個梯度濃度的樣品均設置3個平行樣本.此外,將1mL同樣梯度稀釋操作的上述水樣加入不含磺胺嘧啶的營養培養基中同時進行培養計數操作,用來反映水樣中的異養菌總數目.

1.5 數據分析

1.5.1 磺胺嘧啶抗性異養菌比例 該比例由磺胺嘧啶抗性異養菌數除以相應的總異養菌數得到.

1.5.2 磺胺嘧啶抗性異養菌凈比生長速率采用凈比生長速率來描述污泥負荷對磺胺嘧啶抗性異養菌生長的影響.凈比生長速率采用式(1)計算.

式中:μnet為磺胺嘧啶抗性異養菌凈比生長速率為磺胺嘧啶抗性異養菌濃度變化率,CFU/d;X為SBR混合液中磺胺嘧啶抗性異養菌濃度,CFU/mL;Xin為進水中磺胺嘧啶抗性異養菌濃度,CFU/mL;Xe為出水中磺胺嘧啶抗性異養菌濃度,CFU/mL;Xw為剩余污泥中磺胺嘧啶抗性異養菌濃度,CFU/mL;Qin為日進水量,L/d;Qw為日排泥量,L/d;Qe為日排水量,L/d;V為反應器有效體積,L.

1.5.3 統計分析 統計分析測試采用SPSS19.0進行.利用t-分布來檢驗數據之間的顯著性差異,檢驗過程在顯著性水平為0.05下進行.

2 結果與討論

2.1 污泥負荷對活性污泥系統中磺胺嘧啶抗性異養菌濃度分布的影響

反應器穩定運行期間主要水質參數見表1.可以看出,盡管兩反應器的污泥負荷不同,但它們在好氧條件下進行的有機物降解、硝化反應等都較為充分,說明兩反應器運行穩定,且均處于較優的狀態下運行,且兩個系統對常規指標的去除效果相近,并未因污泥負荷不同而有明顯差異.

不同污泥負荷的兩反應器系統中各點位磺胺嘧啶抗性異養菌濃度和相對豐度(以所占百分比表示)見圖2.進水中磺胺嘧啶抗性異養菌的濃度 為 (4250±250)CFU/mL,所 占 百 分 比 為17.6%±2.6%,由于磺胺類藥物價格低廉在水產和家禽養殖使用較廣泛[14],較高濃度的磺胺類抗生素在我國包括污水廠和其他水環境中也都有檢出[15],這可能導致微生物對磺胺類抗生素的較高抗藥率.

表1 活性污泥系統運行過程中常規指標Table1 Regular wastewater quality index in the activated sludge reactors

圖2 不同污泥負荷的活性污泥系統各點位耐磺胺異養菌濃度和百分比Fig.2 Concentration and percentage of sulfadiazineresistant bacteria in the activated sludge system with different sludge loading rates

在活性污泥混合液樣品中,低污泥負荷樣品抗藥細菌的豐度相比進水無明顯改變,濃度為(5000±1000)CFU/mL,而污泥負荷為0.4的樣品濃度顯著提高(P<0.05),達到(40000±10000) CFU/mL,為低污泥負荷樣品的8倍.在其他運行條件一致的情況下,污泥負荷有利于磺胺嘧啶抗性異養菌在活性污泥系統中的增殖.

污水經處理后反應器出水細菌濃度明顯降低(P<0.05),去除率分別達97.6%和97.0%,但活性污泥系統無法完全去除水中的抗藥細菌,出水中仍含有較高濃度的磺胺嘧啶抗藥異養菌,而且濃度隨著污泥負荷的升高而顯著升高.高污泥負荷下出水抗藥細菌的排放濃度是低污泥負荷的10倍.這表明常規工藝出水是環境中潛在的抗藥細菌儲存庫,后續進一步降低抗藥細菌風險的處理方法(如氯消毒、紫外消毒)仍十分必要.

剩余污泥樣品由于污泥的濃縮細菌的濃度大大提高,抗藥菌濃度也顯著高于其他點位,剩余污泥是污水處理系統中抗藥細菌排放的重要方式.對比不同負荷下抗藥細菌的濃度發現,較高負荷系統中的抗藥細菌濃度(101667±7368) CFU/ mL仍高于低負荷(61667±12583)CFU/mL,但此時兩者的相對豐度相差不大(分別為18.7%和17.4%)且和進水相比無顯著差距.

綜合分析污泥負荷對磺胺嘧啶抗藥細菌豐度的影響,發現負荷提高使抗藥菌在活性污泥、出水和剩余污泥中的濃度均提高.這種提高可能主要是由于負荷提高加快了污泥生長,使抗藥細菌在活性污泥系統中的濃度也相應提高,但從抗藥細菌的相對豐度看,各點位磺胺嘧啶抗藥細菌百分比均不隨污泥負荷的提高而發生顯著改變(P >0.05),表明污泥負荷不會顯著改變活性污泥系統磺胺嘧啶抗藥細菌的抗藥特性.

2.2 污泥負荷對磺胺嘧啶抗性異養菌生長及排放的影響

采用凈比生長速率和細菌產量兩項指標來反映系統中磺胺嘧啶抗性異養菌的生長狀況.從表2可以看出,高負荷下耐磺胺嘧啶異養菌的凈比生長速率略高于低污泥負荷,而產量顯著高于后者,表明污泥負荷的提高有利于磺胺嘧啶抗藥細菌的生長,這也導致高負荷下系統中包括混合液、出水和剩余污泥各點位的細菌濃度均高于低污泥負荷.相比之下兩反應器中異養菌總數的比生長速率分別為0.35和0.38d-1,不同污泥負荷下異養菌總數的生長速率和產量均高于抗磺胺嘧啶異養菌,可能是因為抗性細菌只占總異養菌的一部分,因而產量低于后者,這也導致在混合液中抗性細菌的比例有所降低.

低污泥負荷下磺胺嘧啶抗藥菌的排放比高達28.4,說明在負荷較低的條件下絕大部分抗藥菌都是通過剩余污泥的方式排放,其在出水中的排放量只占極小的比例,負荷提高后,通過出水排放的抗藥細菌量顯著提高,已經接近剩余污泥中的排放量(排放比1.1),成為抗藥細菌排放的主要方式之一,隨著負荷進一步提高,排放比將進一步降低,但進一步增加負荷可能會影響生物處理工藝對常規污染物的去除效果,使出水水質下降.

表2 不同污泥負荷下系統中磺胺嘧啶抗性異養菌生長及排放特性Table2 Propagation and distribution of sulfadiazineresistant bacteria in the activated sludge system with different sludge loading rates

高污泥負荷反應器由于出水抗藥性細菌的排放量顯著增加,其排放總量也顯著升高,從5.9×106CFU/d變為1.8×107CFU/d,但由于此時水力負荷是低污泥負荷下的4倍,相同水力負荷下,高污泥負荷的抗性細菌排放量反而有顯著降低(P <0.05),從抗藥細菌風險控制的角度來看,負荷提高更有利于抗藥細菌的控制.另外,高污泥負荷下排水將成為抗藥性細菌排放的重要形式,就我國目前對污水生物處理工藝出水和剩余污泥的后續處理來看,一般污水廠出水還都會經過深度處理或消毒處理后排放,通常對包括抗藥細菌在內的各類微生物有比較好的殺滅效果;而剩余污泥處理過程復雜,處理費用較高,一般污水廠不會對其進行十分完善的處理,經過常規的濃縮、穩定、脫水過程后,污泥的抗藥性風險可能并未有較明顯降低,因而小污泥負荷處理污水不利于抗藥性風險的控制.另一方面,發展低排泥量的處理工藝,如采用氧化溝或MBR工藝等,可能有助于控制抗藥性風險.當然,本研究僅以磺胺嘧啶抗性異養菌為例考察了其在活性污泥系統中的歸趨行為,其他常見抗性細菌在污水生物處理工藝的歸趨特性以及可能影響抗藥細菌分布的其他運行條件,如曝氣條件,污泥齡,水力停留時間等需要在以后的研究中進一步探討.

3 結論

3.1 污泥負荷增大[0.4kg COD/(kg MLSS?d)]使活性污泥系統中混合液、出水和剩余污泥中磺胺嘧啶抗藥異養菌的濃度顯著提高,分別是低污泥負荷[0.24kg COD/(kg MLSS?d)]下的8倍、10倍和1.7倍;但污泥負荷改變對抗藥細菌的相對豐度無顯著影響.

3.2 污泥負荷的提高有利于活性污泥系統中磺胺嘧啶抗藥細菌的生長,凈比生長速率和細菌產量分別由0.32d-1和2.3×106CFU/d提高至0.33d-1和3.1×106CFU/d.

3.3 較低污泥負荷下抗藥細菌主要通過剩余污泥形式排放,排放比(泥/水)為28.4;負荷提高后,通過出水排放抗藥細菌的比例顯著提高,排放比(泥/水)達1.1.

3.4 處理單位污水,2種污泥負荷反應器磺胺嘧啶抗藥細菌排放量分別為3.3×106CFU/L和2.6×106CFU/L,提高污泥負荷有利于活性污泥系統抗藥性風險的控制.

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致謝：本實驗的現場采樣工作由上海Q污水廠樊工程師等協助完成,在此表示感謝.

《中國環境科學》獲評“2012中國最具國際影響力學術期刊”

2012年12月,《中國環境科學》被評為“2012中國最具國際影響力學術期刊”.

“中國最具國際影響力學術期刊”是中國科學文獻計量研究中心、清華大學圖書館依據《CAJ國際引證報告》,按2011年度中國學術期刊被SCI期刊、SSCI期刊引用的總被引頻次排序并經40多位期刊界專家審議,遴選出的TOP5%期刊.獲評“中國最具國際影響力學術期刊”的科技類期刊共156種.統計分析結果表明,從定量分析的角度看,“中國最具國際影響力學術期刊”的國際影響力已經達到國際中等以上水平,跨入了國際品牌學術期刊行列.

《中國環境科學》編輯部

Effect of sludge loading rate on the growth and distribution of sulfadiazine-resistant bacteria.

YUAN Qing-bin1,2, GUO Mei-ting1,2*, YANG Jian1,2
(1.State key Laboratory of Pollution Control and Resource Utilization Research, Shanghai200092, China；2. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China). China Environmental Science,2014,34(8)：1979～1984

In order to study the propagation and distribution of antibiotic-resistant bacteria (ARB) in the typical biological treatment process, an activated sludge system with different sludge loading rates was constructed. The effect of sludge loading rate on the growth and release of sulfadiazine-resistant bacteria in the system was then studied. The results indicated that a higher sludge loading rate promoted the growth of sulfadiazine-resistant bacteria. The net specific growth rate and the bacteria production increased from0.32d-1and2.3×106CFU/d to0.33d-1and3.1×106CFU/d, respectively. The concentration of sulfadiazine-resistant bacteria in activated sludge, effluent and biosolids all increased significantly (P <0.05) with increased sludge loading rate, while the antibiotic resistant characteristic changed slightly. The biosolids was the main released pattern for sulfadiazine-resistant bacteria in the low sludge loading rate [0.24kg COD/(kg MLSS?d)] system, and the released ratio (biosolid/effluent) was28.4. By comparison, much more bacteria were discharged through effluent in the higher sludge loading rate [0.4kg COD/(kg MLSS?d)] system, with the release ratio (biosolid/effluent) of1.1. The total discharging load decreased significantly in the system with higher sludge loading rate, which was benefical to the potential ARB risk control.

t：activated sludge system；sludge loading rate；sulfadiazine-resistant heterotrophic bacteria；growth；release

X172

：A

：1000-6923(2014)08-1979-06

袁青彬(1987-),男,山東臨沂人,博士研究生,研究方向為污水中耐藥細菌及耐藥基因的分布特性與歸趨.

2013-11-21

上海市自然科學基金(13ZR1443300);國家自然科學基金(51308399)

*責任作者, 講師, guomeiting@tongji.edu.cn