金銀花多糖提取工藝優(yōu)化

何俊婷

(陜西新藥技術(shù)開發(fā)中心，陜西西安 710075)

金銀花為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或初開的花，夏初花開放前采收，干燥。具有清熱解毒、抗炎、補虛療風(fēng)的功效。金銀花化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、黃酮、萜類、多糖、醇類等。現(xiàn)代藥理表明，金銀花多糖具有明顯的免疫增強作用［1］，顯著的抗氧化活性［2］及一定的抗菌作用［3］。

本研究是基于制藥企業(yè)提出其金銀花產(chǎn)品在生產(chǎn)過程中僅僅通過水蒸氣蒸餾法提取了揮發(fā)油，揮發(fā)油入藥后，其他成分未利用而丟棄，造成浪費極大。工業(yè)生產(chǎn)中，金銀花提取揮發(fā)油溫度通常控制在96～100℃，4 h內(nèi)可收集完成所需揮發(fā)油，并能保證水油比穩(wěn)定。為實現(xiàn)企業(yè)的經(jīng)濟利益最大化，企業(yè)提出對金銀花的深度開發(fā)，在水蒸氣蒸餾金銀花揮發(fā)油工藝基礎(chǔ)上，建立水提金銀花多糖工藝。

本實驗針對水提金銀花多糖的提取工藝進行研究。工藝研究采用響應(yīng)面分析方法，實驗得到的數(shù)據(jù)用多元二次回歸方程進行數(shù)據(jù)擬合，確定因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析、響應(yīng)面等高線圖的分析來預(yù)測較優(yōu)工藝參數(shù)。響應(yīng)面分析方法精密度高、預(yù)測值接近真實值。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

無水葡萄糖、氯仿、正丁醇、乙醇、丙酮、苯酚、濃硫酸均為分析純;干燥的金銀花藥材(山東平邑縣)。

AG-135型電子天平;Varian-50CONC型紫外分光光度儀;SHB-B95型真空泵;Heidolph WB-digit型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀;101B-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱。

1.2 多糖提取

將金銀花(干品)250 g加入一定量的水，連接揮發(fā)油提取裝置，回流提取數(shù)次，在提取金銀花多糖的同時收集金銀花揮發(fā)油。收集、合并多次水提濾液，減壓濃縮后用無水乙醇沉淀，抽濾。固體物水溶，sevag法脫蛋白［4］，水層再次醇沉過濾。固體物用乙醇、丙酮、乙醚淋洗，真空干燥得金銀花粗多糖。

1.3 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法［5］測定金銀花提取物中總糖含量。按操作規(guī)程繪制標準曲線，得標準曲線方程y=3.97x+0.001 1，相關(guān)系數(shù) r=0.999 5，濃度范圍在0 ～0.1 mg/mL，線性良好。

精密稱取金銀花多糖樣品20 g，置于100 mL容量瓶中，蒸餾水定容至刻度，吸光光度法［6］求供試品中多糖含量，并計算多糖提取率。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取時間

固定提取次數(shù)2次，液料比10∶1(mL/g)，考察金銀花多糖提取率，結(jié)果見圖1。

圖1 時間對金銀花多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction yield of polysaccharides form Lonicera japonica

由圖1可知，隨著提取時間的增加，多糖提取率快速上升，約120 min時達到最高，時間再延長，提取率反而下降。

2.2 液料比

固定提取時間120 min，提取次數(shù)2次，考察液料比對金銀花多糖提取率的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 液料比對金銀花多糖提取率的影響Fig.2 Effect of water/material ratio on extraction yield of polysaccharides from Lonicera japonica

由圖2可知，液料比為14∶1(mL/g)時，提取率達到最大;液料比再增大，提取率基本保持不變。

2.3 提取次數(shù)

固定提取時間120 min，液料比14∶1(mL/g)，考察提取次數(shù)對金銀花多糖提取率的影響，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，隨著提取次數(shù)的增加，提取率快速上升，提取4次時，提取率上升率明顯趨緩。隨著提取次數(shù)的增加，工藝成本顯著增加。

圖3 提取次數(shù)對金銀花多糖提取率的影響Fig.3 Effect of extraction times on extraction yield of polysaccharides from Lonicera japonica

2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化金銀花多糖提取工藝

實驗依據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，選取提取時間、液料比、提取次數(shù)進行考察。通過Design-Expert 7.1.6響應(yīng)面分析軟件設(shè)計實驗，共17組實驗，其中12個是析因?qū)嶒灒?個中心實驗。因素與水平設(shè)計見表1，實驗結(jié)果見表2。

表1 因素水平表Table 1 Factors and levels table

表2 響應(yīng)面分析實驗方案和實驗結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis

各因素回歸擬合后，得到回歸方程:

當P＜0.000 1時，所對應(yīng)條件對響應(yīng)值的作用是極其顯著的，P＜0.05時影響顯著。經(jīng)分析，回歸方程模型是高度顯著的。用方程描述各單因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系時，因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著(r=1.65/1.65=1)，說明該回歸模型是極其可靠且顯著的，用本模型來估算各因素對金銀花多糖提取過程的影響是合理的。

由表3可知，提取次數(shù)對金銀花多糖提取率影響是高度顯著的，3因素對金銀花多糖提取率影響大小的順序依次為提取次數(shù)＞提取時間＞料液比。提取時間、次數(shù)、液料比這3項的平方項對多糖的提取率影響也很顯著。

2.5 響應(yīng)面圖形分析

響應(yīng)面優(yōu)化分析獲得響應(yīng)面三維圖形，比較三組交互影響圖，提取次數(shù)對響應(yīng)值的影響最顯著，可見其對應(yīng)的曲線較為陡峭，液料比和提取時間兩個因素對應(yīng)的曲線則較平緩，影響顯著性降低。可得到金銀花多糖水提取的最佳工藝條件:液料比12.20 mL/g，提 取 次 數(shù) 3.24 次，提 取 時 間116.65 min，多糖提取率為 3.03%。

圖4 時間與液料比對提取率影響Fig.4 The effects of extraction time and water/material ratio on extraction yield of polysaccharides from Lonicera japonica

圖5 時間與次數(shù)對提取率影響Fig.5 The effects of extraction time and extraction times on extraction yield of polysaccharides from Lonicera japonica

圖6 次數(shù)與料液比對提取率影響Fig.6 The effects of extraction times and water/material ratio on extraction yield of polysaccharides from Lonicera japonica

2.6 驗證實驗

考慮實際操作及實驗條件的可操作性，生產(chǎn)過程經(jīng)濟可行，將優(yōu)化的工藝條件稍微作修正:液料比12 mL/g，提取次數(shù)3次，提取時間116 min。對優(yōu)化的工藝條件進行3次平行實驗。結(jié)果表明，提取率分別為 3.01%，2.99% 和 3.02%，平均提取率3.01%。

3 結(jié)論

在單因素實驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面Box-Behnken設(shè)計方法，進行了提取工藝參數(shù)優(yōu)化研究，得到金銀花多糖提取最優(yōu)化工藝參數(shù)為:液料比12 mL/g，提取次數(shù)3次，提取時間116 min。在此條件下，金銀花多糖提取率為3.01%。

［1］殷洪梅，呂新勇，蕭偉.金銀花多糖的制備工藝優(yōu)化及免疫活性研究［J］.中國中藥雜志，2010，35(4):453-455.

［2］李爾春.金銀花多糖的分離純化與生物活性研究［D］.西安:陜西師范大學(xué)，2009.

［3］林雄平，陳曉清，蘇育才，等.金銀花和苦丁茶多糖提取物抗菌活性研究［J］.亞熱帶植物科學(xué)，2008，37(1):51-53.

［4］殷洪梅，尚強，蕭偉.金銀花多糖脫蛋白方法的研究［J］.中草藥，2010(4):26.

［5］劉龍先，楊曄，梁旭霞.靈芝軟膠囊中靈芝多糖含量測定方法的驗證［J］.中藥材，2004，27(10):778-781.

［6］中國藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.