谷氨酰胺合成酶抑制劑對衰老期煙葉氮代謝的影響

武云杰，楊鐵釗，張小全

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谷氨酰胺合成酶抑制劑對衰老期煙葉氮代謝的影響

武云杰，楊鐵釗*，張小全

（河南農業大學煙草學院，鄭州 450002）

通過質外體提取和測定氮素代謝相關酶等方法，調查了不同濃度谷氨酰胺合成酶（GS）抑制劑（Glufosinate）對2個氮效率烤煙品種氮代謝相關生理指標的影響。結果表明，GS抑制劑可以有效抑制衰老期間煙葉GS活性，使氮素再同化能力下降，促進氮素營養物質的降解，并誘導谷氨酸脫氫酶（GDH）活性升高和硝酸還原酶（NR）活性下降，使葉片NH4+積累，增大了氨氣揮發潛力，且隨著GS抑制劑濃度的升高，抑制效果更加明顯。氮低效品種與氮高效品種相比，衰老速度快，葉片NH4+的積累量小，氨氣揮發潛力大，品種間差異顯著。GS抑制劑可以加速葉片衰老，促進氮素降解和再轉移。

烤煙；氮代謝；氮利用率；谷氨酰胺合成酶抑制劑

氮是影響煙葉產量和品質的重要營養元素之一，不同品種烤煙具有不同的氮代謝特性[1-2]。煙葉衰老期是碳氮代謝轉化的關鍵時期，葉片衰老的主要目的是進行營養的再分解和再轉移，氮素再轉移速率與葉片衰老程度有關[3]。谷氨酰胺合成酶（GS）是煙株氮代謝關鍵酶，植物體內95%的NH4+首先通過GS催化合成谷氨酰胺[4-5]，GS也是調控植物和大氣氨氣交流的關鍵酶，葉片GS活性對植物葉片NH4+濃度有顯著影響[6]，是造成品種間氨氣補償點和氨氣揮發量差異的決定因素[7-8]。GS抑制劑（Glufosinate，4-[羥基（甲基）膦酰基]-D/L一高丙氨酸）的靶標酶是GS[9]，其作用是通過降低GS活性，減少氮素化合物的合成，在植物體內傳導能力強，半衰期短[10]，而且對哺乳動物安全[11]。相關研究表明，GS抑制劑處理小麥葉片后，葉片氮含量顯著下降，并轉移到其他器官[12]。由于烤煙生產是以葉片為收獲目標的，衰老期氮素合成量過大，使煙株生長過旺，氮代謝延長，煙葉成熟期推遲，造成煙葉品質低劣[13]。生產上通過減少生育后期的土壤肥力和控制打頂時間等方法來控制煙葉衰老速度，但是通過GS抑制劑控制GS活性來調控烤煙葉片氮素代謝的研究未見報道。本試驗選用氮高效品種K326和氮低效品種中煙100為試驗材料[14-15]，在煙葉衰老期間通過噴施不同濃度的GS抑制劑，研究烤煙氮素代謝生理指標的變化及其品種間差異，為調控煙葉氮素代謝和指導優質煙葉生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設計

試驗于2011年在河南農業大學科教園區進行（鄭州），采用盆栽培養方法。供試土壤為壤質潮土（取自河南農業大學科教園區），耕層土壤的基本理化性狀為有機質9.58 g/kg、全氮0.87 g/kg、速效氮64.46 mg/kg、速效磷25.42 mg/kg、速效鉀105.00 mg/kg，pH 7.88。參試烤煙品種為K326和中煙100。5月15日選取生長一致的壯苗，分別移栽于裝有15 kg土壤的塑料盆中，每盆1株。分別施用分析純NH4NO3、NaH2PO4和K2SO4，N、P、K的用量分別為0.13、0.13、0.39 g/kg，穴施，分移栽時、移栽后第1周、第2周3次施入，3次施肥量比例為2:1:1。每品種300株，常規水分管理。每個品種各選取整齊一致的單株100株，以第11片葉（自下向上數）為試驗對象，在葉齡40 d用濃度0.005%和0.01%的GS抑制劑均勻噴施葉片（第11片葉），以清水處理為對照，第1次取樣在噴施后6 h，之后在葉齡50 d（即噴施后10 d，以此類推）、60 d和70 d（以幼葉長1 cm，寬0.5 cm時作為葉齡第1天）取不同濃度GS抑制劑和清水處理的葉片為待測樣品。各項指標測定重復3次。

1.2 測定項目與方法

1.2.1 葉片銨態氮、總氮和可溶性蛋白含量的測定 葉片銨態氮、總氮和可溶性蛋白分別用茚三酮法、凱氏定氮法、考馬斯亮藍G-250法[16]進行測定。

1.2.2 谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）和硝酸還原酶（NR）活性的測定 按照O’Neal等的方法[17]測定粗酶提取液GS活性。一個GS活性單位定義為該反應條件下，在15 min反應時間內催化形成1 μmolγ-谷氨酰異羥肟酸需要的酶量，總活性為：每克鮮樣酶粗液在每小時的反應時間內催化形成的μmol數。總GS活性計算以每分鐘每毫克粗蛋白催化產生的γ-谷氨酰異羥肟酸μmol數表示。GDH參照Turano等的方法[18]。在340 nm處測定30 s內吸光值的變化。以每分鐘反應混合液于30 ℃減少1 μmol的NADH定義為一個酶活性單位。總GDH活性計算以每分鐘每毫克粗蛋白催化NADH減少的μmol數表示。NR采用活體法[16]，在540 nm處測定，以每克鮮樣酶粗液在每小時的反應時間內催化形成的1 μg亞硝態氮（NO2-）為一個酶活性單位。

1.2.3 質外體銨離子濃度和pH測定 質外體提取參照Husted等[19]的方法，在室溫（20～25 ℃）進行滲透，從取葉到提取結束控制在20 min以內。細胞質污染檢驗：采用蘋果酸脫氫酶（EC 1.1.1.38）測定法檢驗提取出的質外體溶液純度，即質外體受細胞質污染的程度[15]。稱取采集的葉片0.5 g左右剪碎，加入提取液（0.1 mol/L的TES，2 mmol/L的DTT和0.2 mmol/LEDTA，pH 7.5）研磨成勻漿（葉片與提取液質量比1:5），在4 ℃以下10 000g離心10 min，取上清液100 μL與質外體提取液100 μL分別加入3 mL比色介質（0.094 mmol/L NADH，0.17 mmol/L草酰乙酸，0.05 mol/L TES）在340 nm處比色，比較兩者蘋果酸脫氫酶活力。若質外體溶液蘋果酸脫氫酶活力與葉片蘋果酸脫氫酶活力比值小于3%即合格，本試驗測定值為1.73%。用連續流動分析儀（Bran Luebbe AA3）測定質外體NH4+濃度。選用1.0和10.0 μg/L NH4+的標準溶液（NH4Cl去離子水溶液），去離子水為零標準。質外體pH用微電極（Mettler Toledo, Inlab 423, Electroly, 9811）直接在微型離心管內測定。

1.2.4 氣孔氨氣補償點的計算 參考文獻[20-21]的方法，在質外體pH范圍內，當K<[H+]apo時，可根據以下方程計算氨氣補償點（χs，濃度單位nmol NH3/mol，air）：

χs= Г × K×K

其中，Г是[NH4+]apo和[H+]apo之比，代表不依賴于溫度的氨氣交換潛力，[H+]apo是測定的質外體NH4+濃度，[H+]apo通過測定的質外體pH換算成氫離子（H+）濃度而得到。K和K是熱動力學常數，分別為10-1.76L/mol和10-9.25mol/L（25 ℃）。由于質外體中離子生理強度通常在14到28 mmol/L之間[22-23]，依照Debye-Hückel方程[24]將K值調整為K= 10-9.32mol/L（25 ℃），K值不變。

1.3 數據處理

采用SPASS 17.0 對數據進行統計分析。

2 結 果

2.1 葉片谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸脫氫酶（GDH）和硝酸還原酶（NR）活性的變化

GS是氮素代謝中同化和轉移NH4+的關鍵酶，也是防止葉片NH4+積累到有害濃度的關鍵酶[5,8]，GDH是氮代謝的調節酶，具有合成氨和脫氨的功能[25]，在衰老后期的主要功能是脫氨[26]，而NR是植物氮同化代謝關鍵步驟硝酸鹽同化中的限速酶和調節酶[27]。由表1可知，衰老過程中GS和NR活性大幅下降，GDH則呈現先升后降的趨勢，品種間差異極顯著。噴施GS抑制劑后，明顯抑制了GS的活性。0.005%的抑制劑濃度在處理當天，分別使中煙100和K326的GS活性下降14.82%和30.13%，葉齡50~70 d，中煙100和K326的GS活性與對照相比降幅分別在21.03%~24.34%和39.49%~42.45%。而用濃度0.01%的GS抑制劑處理后，在葉片衰老期間中煙100和K326的GS活性與對照相比降幅分別在40.19%~43.52%和48.94%~55.61%。處理間均達到極顯著差異。

GDH活性表現為處理均高于對照，且兩品種隨GS抑制劑處理濃度的增大而逐漸增大，但品種間同一處理下K326的增幅均大于中煙100，處理間僅在葉齡40 d時差異未達到極顯著水平。NR活性與GS活性變化趨勢一致，但降幅較小，而且不同濃度的GS抑制劑處理煙葉后，NR活性降幅變化不大。說明GDH和NR作為氮素代謝的調控酶其活性可能受誘導而變化。中煙100與K326相比的GS和NR活性低，GDH活性高，氮素合成能力弱，轉移量大，GS抑制劑可以有效抑制氮素的同化，增大對氮素的轉移，同化量隨抑制劑濃度的增大而減少。

2.2 葉片NH4+濃度、可溶性蛋白和總氮含量變化

葉片衰老過程中NH4+的積累是氮素物質降解的結果[28]，而且NH4+是氮素代謝的一個核心中間體[29]。由表2可以看出，衰老過程中未經處理的煙葉葉片NH4+濃度、可溶性蛋白和總氮含量均呈下降趨勢，中煙100總氮含量降幅達到57.85%，K326只有32.39%，中煙100的可溶性蛋白降解量顯著高于K326。隨著GS抑制劑濃度的升高，可溶性蛋白和總氮含量明顯下降，K326的降解量大于中煙100，兩品種在葉齡60 d以后的總氮含量相差不大。氮素物質的降解伴隨著葉片NH4+濃度的大幅上升，中煙100和K326均在葉齡50 d達到高點，0.005%的抑制劑濃度與對照相比增幅分別達到54.22%和42.45%，0.01%的抑制劑濃度與對照相比增幅分別57.96%和49.72%。而且K326的高峰期較長，衰老期處理后的葉片NH4+濃度均在（4.18±0.10） mmol/L以上，與中煙100相比差異達到極顯著水平。但是從降解量來看，總氮和可溶性蛋白與葉片NH4+濃度的變化并不完全一致。表明中煙100氮素物質降解快，對NH4+的轉移能力強，隨GS抑制劑濃度的增加，氮素營養物質降解量增大，K326產生了大量的NH4+并長期積累到較高濃度，可能與不同品種的NH4+再轉移途徑和能力有關。

表1 不同濃度GS抑制劑對葉片GS、GDH和NR活性的影響

Table 1 The influence of GS inhibitors concentrations on the GS, GDH and NR activities in tobacco leaves

注：同一列內大寫字母不同表示1%極顯著差異，下同。

表2 不同濃度GS抑制劑對葉片銨、可溶性蛋白和總氮含量的影響

Table 2 The influence of GS inhibitors concentrations on the concentration of ammonium, soluble protein and total nitrogen in tobacco leaves

2.3 葉片質外體NH4+濃度、pH和氨氣補償點的變化動態

氨補償點是根據葉片質外體NH4+濃度與pH計算得到的，氨氣補償點隨著葉片的衰老而升高，葉片具有更大的氨氣揮發潛力[7-8]。由表3可知，正常葉片中煙100質外體NH4+濃度顯著高于K326，pH也高于K326，氨氣補償點在葉齡40~60 d均達到了K326的一倍以上，品種間差異極顯著。煙葉噴施GS抑制劑后質外體NH4+濃度均大幅升高，而且K326高峰階段時間長，不同濃度均在葉齡60 d和70 d大于中煙100，質外體pH也有小幅上升。氨氣補償點大幅升高，表現為中煙100增幅大于K326，并且增幅隨抑制劑濃度的增加而增大。與表2對比可以看出，氨氣補償點、質外體和葉片NH4+濃度的變化趨勢一致。說明GS抑制劑明顯提高了葉片的氨氣揮發潛力，在同化量減弱的情況下，葉片可以通過質外體揮發氨氣達到對NH4+的調控，既減少了葉片NH4+積累而產生的毒害，又使其同化量減少，品種間氨氣補償點存在顯著差異。

表3 不同濃度GS抑制劑對葉片質外體NH4+濃度、pH和氨氣補償點的影響

Table 3 The influence of GS inhibitors concentrations upon the apoplastic NH4+concentration, pH and NH3compensation point in tobacco leaves

3 討 論

葉片衰老的主要目的是進行營養的再轉移和再利用，氮素再轉移速率與葉片衰老程度有關[3]。GS是氮代謝中同化和轉移NH4+的關鍵酶，也是防止葉片NH4+積累到有害濃度的關鍵酶。噴施GS抑制劑后，K326的GS活性大幅下降之后，其衰老速度也明顯加快，但葉片NH4+濃度持續偏高。煙葉中GDH在衰老期的主要功能是脫氨[25-26]，GDH活性上升和NR活性下降，使煙葉氮素同化能力減弱，大量的NH4+積累加劇了葉片中氮素的流失。但是正常衰老的煙葉和GS抑制劑處理的煙葉，其葉片NH4+濃度并沒有表現出持續上升，表明作物可能存在某種相應的補償機制來消除葉片NH4+的積累[30-31]。

質外體是NH4+的動力池，大量的NH4+運輸到質外體成為葉片氨氣揮發的來源[32-33]，相關研究也證明，由于葉片NH4+的積累，使質外體NH4+濃度和氨氣補償點升高氨氣揮發潛力增大[6-7]。噴施不同濃度GS抑制劑后，葉片NH4+的代謝由同化轉為再轉移，并在噴施當天葉片NH4+濃度和pH均上升，但是K326的質外體pH上升幅度較小，造成了氨氣補償點較低。結果表明氮高效烤煙葉片在衰老速度加快、NH4+同化量低和積累量大的情況下，其氨氣揮發潛力也大幅增加，但調控能力較弱，調節時間長，可能與其自身調節NH4+的運輸方式和質外體環境有關[5,8]。通過質外體揮發氨氣等途徑是葉片NH4+再轉移量增大，減少了NH4+的積累和毒害。

本試驗通過對2種氮效率烤煙衰老期間的葉片進行不同濃度GS抑制劑處理，結果表明，GS抑制劑可有效抑制煙葉GS活性，并有效促進了煙葉氮素物質的降解，氨氣揮發潛力增大，而且隨著GS抑制劑濃度的升高，抑制效果更加明顯。氮低效類型烤煙葉片衰老速度快，氮素降解量和再轉移量大，同化量小，有利于煙葉成熟落黃[1,34]。而氮高效品種烤煙GS活性較高，對NH4+的同化量大，在加速衰老的情況下，對NH4+調控時間長，因此不同品種和代謝階段的煙葉對GS抑制劑的反映存在差異。另外氮素再轉移途徑與氨氣揮發所必備的氣孔開關、質外體微環境和pH等條件有關[33]，品種間再轉移途徑的差異需要做進一步研究。

4 結 論

本試驗結果表明，GS抑制劑在煙葉成熟期間明顯抑制了GS活性，并通過誘導GDH和NR活性的變化，使葉片衰老加快，氮素降解量增大，再轉移能力增強。GS抑制劑濃度越高，抑制效果越強。氮低效品種烤煙衰老速度快，時間早，氮素再同化能力弱，再轉移能力強，與氮高效品種相比差異極顯著，對GS抑制劑的反映不同。合適濃度的GS抑制劑可以促進氮素的降解和再轉移，有利于煙葉的成熟落黃。氮素再利用和再轉移途徑的不同，可能是導致品種間氮素代謝差異的重要因素。

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The Influence of Glutamine Synthetase Inhibitors on Nitrogen Metabolism of Tobacco Leaves during Senescence Period

WU Yunjie, YANG Tiezhao*, ZHANG Xiaoquan

(Collage of Tobacco, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

By using the method of apoplast extraction and determination of enzymes related nitrogen metabolism, the influence of Glufosinate (GS) inhibitor concentrations on nitrogen metabolism physiological indices of flue-cured tobacco varieties with two nitrogen use efficiency were studied. The results show that GS inhibitors could inhibit GS activity of tobacco leaf during senescence, reduce the ability of nitrogen assimilation, promote the degradation of nitrogen nutrient, induct the increasing of glutamate dehydrogenase (GDH) activity and decreasing of nitrate reductase (NR) activity and promote accumulation of leaf NH4+, increase ammonia volatilization potential. These inhibition effects became more obvious with increasing GS inhibitor concentration. Compared with high nitrogen efficiency varieties, low nitrogen efficiency varieties aged more rapidly and had a lower NH4+accumulation and ammonia volatilization potential. There was significant difference between varieties. This shows that GS inhibitors can accelerate leaf senescence and promote nitrogen degradation and transfer.

flue-cured tobacco; nitrogen metabolism; physiological N utilization efficiency; glutamine synthesis inhibitors

S572.01

1007-5119（2014）01-0037-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.007

中國煙草總公司重大專項（Ts-01-2011003）；中國煙草總公司項目（110201602008）

武云杰，男，碩士研究生，研究方向為煙草遺傳育種與品質改良。E-mail：wuyunjie6@163.com。

通信作者，E-mal1：yangtiezhao@126.com

2012-04-24