連作煙田土壤根系分泌物的變化和分解

于會泳，申國明，高欣欣,2

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連作煙田土壤根系分泌物的變化和分解

于會泳1，申國明1，高欣欣1,2

（1.中國農業科學院煙草研究所，農業部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

為闡明煙田土壤中根系分泌物的變化規律及確定具有化感作用的根系分泌物種類，研究分析了種煙1年、連作2年和連作3年0~20 cm、20~40 cm煙田土壤中根系分泌物的含量變化，并通過室內試驗研究了煙草根系分泌物的分解轉化。結果表明：（1）煙田土壤中含量較高的根系分泌物種類有苯甲酸、4-羥基苯乙酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸和鄰苯二甲酸二辛酯，其中4-羥基苯乙酸含量最高，含量較低的種類有4-羥基丁酸和甘油；（2）羥基丁酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基丁酸、肉桂酸、油酸、硬脂酸酰胺和煙堿對煙草無直接化感作用；（3）室內試驗表明，肉桂酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、鄰苯二甲酸、3-羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二辛酯、4-羥基苯乙酸和肉豆蔻酸的分解轉化率均小于50%；（4）初步判定具有化感作用的根系分泌物種類包括：苯甲酸、3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、月桂酸、鄰苯二甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、苯丙酸、東良菪素、肉桂酸、鄰苯二甲酸二辛酯和4-羥基苯乙酸。

煙草；土壤；化感物質；分解轉化

化感物質幾乎全為植物的次生代謝物質，主要種類有簡單不飽和脂肪酸、長鏈脂肪酸和多炔、醌類、苯甲酸及其衍生物、肉桂酸及其衍生物、香豆素類、類黃酮類、單寧、內萜、氨基酸和多肽、生物堿和氰醇、硫化物和芥子油苷、嘌呤和核苷等14類，其中低分子量有機酸、酚類和萜類化合物最為常見，其在植物體內的合成途徑模型由Rice[1]最早得出，Birkett等[2]對一些化感物質進入根際的途徑進行了詳細闡述。化感物質對作物生理[3-8]、土壤理化性質[9-11]具有重要影響。化感效應在一定的濃度基礎上才能表現出來，自然狀態下根系分泌物的化感物質含量極少，不足以發揮化感效應[2]。根系分泌的化感物質首先進入根際土壤，隨土壤水分進行遷移，受土壤質地、粒徑結構及有機質等多種因素影響，在土壤中的行為極其復雜，包括吸附解析過程、轉化和降解與滯留過程。孔垂華等[12]發現勝紅薊產生的重要化感物質勝紅薊素的轉化與土壤營養水平顯著相關，在營養條件好的土壤中首先聚合成二聚體，26 d后解聚為勝紅薊素，然后降解為無活性的小分子物質，在低營養水平的土壤中直接降解為小分子物質。

煙草根系分泌物中的化感物質被認為是造成連作障礙的重要原因[13-15]。研究煙田土壤中根系分泌物的分布與轉化規律有助于闡明化感物質種類。

1 材料與方法

1.1 供試土壤

供試土壤于2011年10月中旬采自于山東省日照市五蓮縣于里鎮現代煙草農業科技示范園“山東基本煙田綜合治理”項目土壤質量長期定位監測點，土壤類型為潮棕壤。煙草根系分泌物降解研究取連作3年0~20 cm耕層土壤進行試驗；不同連作年限煙田土壤根系分泌物變化研究試驗所用土壤為種煙1年、連作2年和連作3年的0~20 cm、20~40 cm土壤。

取樣方法：在煙葉收獲后，用土鉆在相應的處理地塊中沿“S”形多點取樣，每個樣品取土約2 kg，在實驗室用四分法分取，所得土壤樣品經處理后待用。土壤基礎理化性質如表1。

1.2 方法

1.2.1 煙草根系分泌物降解試驗土壤處理方法 撿除新鮮土壤中的石塊和植物殘體，過2 mm篩，調節含水量，達到手感濕潤但不結塊，混勻，此時土壤含水量約為飽和持水量的40%。取處理好的鮮土1 kg，放置于25 ℃、黑暗環境中，放置1小杯1 mol/L NaOH溶液用于吸收土壤呼吸釋放的CO2，1小杯水用于保持土壤濕度，3次重復，每3 d取樣1次，每次取25 g，共取5次，即檢測土壤15 d內根系分泌物的含量變化，其中取處理好的土壤25 g做為初始樣品。

1.2.2 土壤根系分泌物檢測方法 取25 g鮮土置于50 mL離心管中，3次重復，加入25 mL、1 mol/L NaOH放置過夜，次日180 r/min振蕩30 min，用高速離心機（6000 r/min）對振蕩液進行離心7 min，過濾液用12 mol/L的HCl酸化至pH 2.5，2 h后用高速離心機（6000 r/min、7 min）除去胡敏酸，而后上清液過0.22 μm的纖維素薄膜，濾液用Agilent 1290—6430超高壓液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀進行檢測。其中煙堿采用正離子模式進行檢測，其他物質采用負離子模式進行檢測。

1.2.3 檢測條件 儀器：Agilent 1290—6430超高壓液相色譜-三重四極桿串聯質譜聯用儀。色譜條件：色譜柱ACQUITY UPLC?HSS T3（2.1 mm×150 mm×1.8 μm）；流動相：A為5%乙腈·H2O；B為乙腈；流速0.2 mL/min；柱溫25 ℃；進樣體積10 μL，梯度洗脫條件見表2。MS條件：離子源ESI，掃描范圍50~500 m/z；毛細管電壓：正離子模式4 KV，負離子模式-4 KV；干燥氣溫度350 ℃；干燥氣流速10 L/min；霧化氣壓力40 psi。

表1 供試土壤理化性質

表2 梯度洗脫條件

1.2.4 數據分析 采用SAS 9.1.3進行統計分析。

2 結果與討論

2.1 不同連作年限煙田土壤根系分泌物的含量變化

表3為不同連作年限煙田0~20 cm和20~40 cm土壤根系分泌物的含量變化，從中可看出：（1）不同連作年限的土壤中不包含2-羥基丙酸和硬脂酸；（2）煙田土壤中含量較高的根系分泌物種類包括苯甲酸、4-羥基苯乙酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸和鄰苯二甲酸二辛酯，其中4-羥基苯乙酸含量最高；含量較低的種類有4-羥基丁酸和甘油；（3）0~20 cm耕層土壤中隨著連作年限增加而增加的根系分泌物種類有：苯甲酸、硬脂酸酰胺和鄰苯二甲酸二丁酯，其中苯甲酸在20~40 cm也隨連作年限的增加而增加。煙草隨著連作年限增加所受到的不良影響越大[16]，所以苯甲酸很可能為隨著濃度增加而對煙草產生不良影響的化感物質。苯甲酸和肉桂酸以及水楊酸也已在番茄、辣椒、西瓜、甜瓜和楊樹的根系分泌物中被鑒定出來具有化感作用，通過影響離子吸收、水分吸收、光合作用、蛋白質和DNA合成等多種途徑影響作物生長[17-19]。（4）羥基丁酸、丁二酸、油酸、硬脂酸酰胺和3-甲氧基-4-羥基苯乙酸含量在0~20 cm和20~40 cm的土壤中以連作2年最高；4-羥基苯乙酸的含量連作2年最低；3-甲基-2-羥基丁酸、肉桂酸含量在0~20 cm土壤中以連作2年最高，在0~40 cm土壤中的含量隨連作年限增加而減少，因為隨著連作年限的增加，煙草連作障礙越嚴重，直接產生化感作用的物質含量應越來越高，所以排除這幾種物質是直接起化感作用的物質。（5）煙堿含量是采用正離子模式檢測的，含量無法與其他物質進行對比，連作2年的土壤煙堿含量較第1年種煙與連作3年低，排除其作為直接化感物質的可能性。

表3 不同連作年限煙田土壤根系分泌物的含量變化

Table 3 The Variation in contents of root exudates in different tobacco planting systems

注：表中數據無單位，為粒子流強度，是波面積的積分，代表物質含量大小。表4同。

2.2 煙草根系分泌物的分解轉化

為了進一步確定煙草根系分泌物中的化感物質種類，通過室內實驗，研究了根系分泌物的分解轉化。表4為經培養0、3、6、9、12、15 d后根系分泌物的含量變化。可看出經培養15 d后，所有根系分泌物均被不同程度分解轉化，其中甘油完全被分解轉化，NC89與K326共有的根系分泌物2-羥基丙酸和硬脂酸在本試驗中未被檢測到，所以排除這3種物質作為化感物質的可能性；丁二酸是三羧酸循環中一種有機酸，不是化感物質；其他種類的分解轉化率為24.6%～79.5%，超過50%的13種，其中肉桂酸最低，油酸最高。

表4 煙草根系分泌物的分解轉化

注：同一物質不同時間數據間均呈顯著性差異（<0.5）。

化感效應的發揮必須建立在一定濃度基礎之上，從濃度的角度可認為越易分解轉化的物質作為化感物質的可能性越小。根系分泌物中分解轉化率超過70%的種類有油酸、硬脂酸酰胺、煙堿，認為它們是化感物質的可能性小，煙草根系分泌物分解轉化率小于50%的種類有肉桂酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、鄰苯二甲酸、3-羥基苯甲酸、鄰苯二甲酸二辛酯、4-羥基苯乙酸和肉豆蔻酸，認為它們是化感物質的可能性大。

各種物質分解轉化規律不同，其中第3~6天轉化較快的根系分泌物種類包括9，12-十八碳二烯酸、硬脂酸酰胺和己二酸二辛酯；鄰苯二甲酸和鄰苯二甲酸二丁酯在第9~12天分解轉化較快；3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基苯乙酸和苯基酸在第6~9天分解轉化最快。化感物質的分解轉化有理化與生物學過程，根系分泌物可為土壤微生物提供營養，生物作用可能在根系分泌物的轉化過程中起主要作用。本研究主要考慮了土壤生物學過程對根系分泌物分解轉化的影響，其他因素如晝夜溫差、土壤含水量和光照等變化對根系分泌物也有顯著影響。

3 結 論

化感物質應具有累積性，因為煙草因連作年限的增加所受到的影響越大，所以化感物質在連作時間長的土壤中含量越高，化感物質也應具有不易轉化性，這樣才能體現出化感作用。

本研究發現，最可能對煙草具有化感作用的物質為苯甲酸；其次為3-羥基苯甲酸、4-羥基苯甲酸、月桂酸、鄰苯二甲酸、3-甲氧基-4-羥基苯乙酸、3,4-二羥基苯甲酸、肉豆蔻酸、棕櫚酸、9,12-十八碳二烯酸、鄰苯二甲酸二辛酯、4-羥基苯乙酸、苯丙酸和東良菪素以及煙堿；對煙草不直接起化感作用的物質包括羥基丁酸、3-甲基-2-羥基丁酸、4-羥基丁酸、肉桂酸、油酸、硬脂酸酰胺，但不能排除他們的間接作用。

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The Changes and Degradation of Tobacco Root Exudates in Tobacco Field with Continuous Cropping

YU Huiyong1, SHEN Guoming1, GAO Xinxin1,2

(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory of Tobacco Biology and Processing, Ministry of Agriculture, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of CAAS, Beijing 100081,China)

We analyzed contents of tobacco root exudates in 0-20 cm and 20-40 cm soil where tobacco had grown for 1 year, 2 years, and 3 years in order to investigate variation of exudates in tobacco field and identify allelochemicals. The results showed that the content of benzoic acid, 4-hydroxyphenylacetic acid, 3-oxygen-4-hydroxyphenylacetic acid and phthalic acid dioctyl ester in tobacco field were high, of which 4-hydroxyphenylacetic acid was the highest, and the content of 4-hydroxybutyric acid and glycerin were low. Hydroxybutyric acid, 3-methyl-2-hydroxy butyric acid, 4-hydroxybutyric acid, cinnamic acid, oleic acid, stearic acid amide and nicotine had no direct allelopathic influence to tobacco. The decomposition rates of cinnamic acid, 3-methoxy-4-hydroxyphenyl acetic acid, phthalic acid, 3-hydroxy benzoic acid, dioctyl phthalate, 4-hydroxyphenyl acetic acid and myristic acid were less than 50%. We proposed that the following acids were allelochemicals, including benzoic acid, 3-hydroxybenzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, lauric acid, oterephthalic acid, 3-methoxy-4-hydroxyphenyl acetic acid, 3,4-dihydroxybenzoic acid, myristic acid, palmitic acid, 9,12-octadecadienoic acid, acrylic acid, scopoletin, cinnamic acid, phthalic acid dioctyl phthalate and 4 - hydroxyphenylacetic acid.

tobacco; soil; allelochemical; decomposition

S572.01

1007-5119（2014）01-0043-05

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.008

青島市科技局，青島市公共領域科技支撐計劃項目“煙草根系分泌物對土壤生物學性質的影響規律研究”（12-1-3-47-nsh）；山東省煙草專賣局重大科技專項“山東基本煙田土壤綜合治理研究”{魯煙科[2010]19號}

于會泳，男，助理研究員，主要研究領域為煙草栽培。E-mail：110138406@qq.com

2012-06-15

2013-05-07