煙草黑脛病抗性的漂浮苗鑒定方法

李梅云，劉 勇，肖炳光，冷曉東，李永平

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煙草黑脛病抗性的漂浮苗鑒定方法

李梅云，劉 勇，肖炳光，冷曉東，李永平

（云南省煙草農業科學研究院，中國煙草育種研究南方中心，云南 玉溪 653100）

煙草黑脛病是煙草生產上的毀滅性病害之一。建立煙草黑脛病抗性的漂浮苗接種鑒定方法，對抗病育種具有重要意義。通過分離菌株的致病性測定，確定了用于抗病性鑒定等后續研究的黑脛病菌162#菌株。研究了煙草黑脛病菌漂浮苗接種鑒定方法，分析了不同接種條件對煙草黑脛病溫室鑒定結果的影響。結果表明，40 d苗齡接種、池內水溫28 ℃、創傷接種鑒定方法比較適宜品種的抗性鑒定與評價。分別采用漂浮苗接種法、溫室盆栽接種法和田間病圃接種鑒定法對煙草品種進行了黑脛病的抗性鑒定，對比了3種不同鑒定方法的鑒定效果和優缺點，建立了水培接種鑒定方法。

煙草；黑脛病；抗性鑒定；漂浮苗

煙草黑脛病是煙草（L.）生產上的毀滅性病害之一，是制約我國各煙區煙葉生產的最重要因素之一，可以危害烤煙、晾煙、曬煙、白肋煙、香料煙等所有的栽培煙草[1-4]。美國北卡羅萊納州每年因煙草黑脛病損失的煙葉約占總產量的1%～2%，1995—1996年兩年間因黑脛病造成的損失達3610萬美元，占病害總損失的35.13%，居各病害之首。該病在我國分布范圍很廣，除黑龍江省尚未發現之外，其余各植煙省區（含臺灣省）均有發生。平均發病率為5%～12%，嚴重田塊發病率高達75%，甚至造成絕收[5-6]。據不完全統計，我國煙草黑脛病平均每年發病面積高達76 373 hm2，產量損失28 69.26萬kg，產值損失超過1.23億元[5]。生產實踐表明，選育抗病品種是防治黑脛病最經濟、有效、環保的措施[7]，抗性鑒定自然成為抗源挖掘利用、抗病育種、抗性監測等工作中重要的一環。

現有的煙草抗性鑒定方法主要有溫室苗期鑒定接種法和病圃活體菌株人工接種鑒定法。苗期鑒定法通常采用游動孢子或菌絲體懸浮液浸根接種，病圃活體菌株人工接種鑒定是目前常用的鑒定方法，缺點是移栽緩苗后接種，時間長，工作量大。

目前我國煙草普遍采用漂浮育苗，漂浮育苗是當前國際上先進的育苗技術，具有壯苗率高、操作簡便、專業化程度高、省工節時、方便管理、有利環境保護等許多優點，近年來，在全國得到了大面積推廣應用。因此，在漂浮育苗基礎上，建立煙草黑脛病抗性的漂浮苗水培接種鑒定方法，對抗病種質資源篩選、抗性遺傳特性研究和抗病育種具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試煙草材料為革新三號、G28、K326、KM10、NC89、金星6007、小黃金1025和紅花大金元。所有菌株均采自云南各主要產煙地州，于2004—2005年間先后分離純化。

1.2 致病性測定

2008年溫室內進行。供試菌種于燕麥瓊脂培養基28 ℃培養7 d。煙苗移栽前兩周，挑取菌絲體接種培養液，120 r/min、28 ℃搖床培養兩周，驟然降溫，制成游動孢子懸浮液。調節游動孢子懸浮液濃度1×108cfu/mL，備用。

供試煙草品種采用漂浮育苗，待煙苗長到6~8葉期移栽到塑料花盆（Φ16 cm）中，緩苗生長10 d。

用孢子懸浮液灌根接種紅花大金元10葉期左右大小煙株。采用莖基部創傷接種法：在煙苗莖基部劃一傷口，游動孢子懸浮液灌根接種于傷口處，脫脂棉保濕。每株15 mL，每菌株設3個重復，每重復16株，設清水對照。接種3 d后開始進行調查，按照嚴重度分級標準進行分級，計算發病率與病情指數。

1.3 室內苗期抗性鑒定

1.3.1 漂浮苗接種鑒定 2009—2011年在溫室內進行。池水保溫循環漂浮池建造方法：池底墊一層厚約4 cm的泡沫塑料板，鋪2層池膜，整個池壁四周用泡沫塑料板保溫。苗池一端設控溫電加熱棒和池水循環泵，通過控溫裝置聯動，設置水溫為28 ℃。煙苗一次剪葉后（苗齡40~50 d），每個材料挑選45株，移植到新的漂浮盤中。將保存的黑脛病菌株使用前在燕麥培養基上活化后，接種燕麥液體培養基28 ℃，150 r/min搖床培養2周，加0.1%硝酸鉀溶液。采用莖基部創傷接種法，方法同1.2。接種后將育苗盤放入恒溫池，及時噴水保持較高濕度，誘發病害產生。接種后5 d開始調查病情，每隔3 d調查1次，計算發病率與病情指數，以感病對照病情指數達到60以上的調查結果作為品種抗性評價標準。

1.3.2 土壤盆栽傷根接種鑒定 2009—2011年在溫室內進行。苗齡50 d，每材料30株，移栽入直徑12 cm的一次性塑料花盆。緩苗后采用莖基部創傷接種法，方法同1.2致病性測定。通過通風簾控制室內溫度。接種后每周觀察一次發病情況，以感病對照病情指數達到60以上的調查結果作為品種抗性評價標準。

1.4 病圃接種發病鑒定

2009—2011年在煙田黑脛病圃中進行。田間設計隨機排列，每品種設3次重復，每重復種植15株。行株距為1.2 m×0.50 m。其他田間栽培管理按當地優質煙生產技術進行。

1.5 病情調查與抗性評價

病害嚴重度分級標準按照GB/T 23222—2008的規定[8]。抗性評價標準按照GB/T 23224—2008的規定[9]。

2 結 果

2.1 致病性測定

對現有菌株致病力的測定結果表明（表1），分離自云南文山的162#菌株致病力最強。

2.2 漂浮苗接種黑脛病抗性鑒定方法發病情況

在塑料拱棚溫室內漂浮苗接種試驗中，不同抗性品種的病情指數差異明顯。創傷接種的煙苗病情指數明顯高于非創傷接種病指，且接種濃度高發病重。說明用病原培養原液接種并同時采用創傷接種法效果最好（表2）。

表1 分離菌株的致病力測定

在塑料拱棚溫室內漂浮苗接種試驗中，感病對照紅花大金元、小黃金1025接種后第3天開始零星發病，隨后發病迅速，且無其他病害干擾。40 d苗齡接種、池內水溫28 ℃比較適宜品種的抗性鑒定與評價（表3）。

2.3 漂浮苗接種、土壤盆栽接種與田間病圃接種的抗性結果比較

在漂浮苗接種抗性鑒定中，已知抗黑脛病的G28、革新三號、K326表現為中抗，中抗品種NC89、金星6007表現中抗，感病對照紅花大金元和小黃金1025表現為感病，高感的KM10表現為高感。在苗期土壤盆栽傷根接種抗性鑒定中，已知抗黑脛病的G28、革新三號、K326表現為中抗，中抗品種NC89、金星6007表現中抗，感病對照紅花大金元和小黃金1025表現為感病，高感的KM10表現為高感。漂浮苗接種法與苗期土壤盆栽傷根接種法得到的供試品種的病情指數表現為正相關，相關系數為0.9160。田間病圃接種抗性鑒定中，已知抗黑脛病的G28、革新三號、K326表現為中抗，中抗品種NC89、金星6007表現中抗，感病對照紅花大金元和小黃金1025表現為感病，高感的KM10表現為高感。漂浮苗接種、土壤盆栽傷根接種和田間病圃接種鑒定的結果與品種本身抗性基本吻合（表4）。

表2 不同方法和不同濃度接種對黑脛病病情指數的影響

表3 不同溫度和不同苗齡接種對黑脛病病情指數的影響

3 討 論

漂浮苗接種鑒定方法與現有技術相比具有如下的優點：1）在塑料拱棚溫室中均勻提高土壤溫度難度大，恒溫溫室造價高。本發明通過在普通漂浮池基礎上，增加簡單的保溫材料、加熱控溫設備和水循環泵，以低成本成功解決了溫度問題。2）采用市售的肥料和自來水配制營養液，與MS營養液和無菌水相比，成本大幅度降低。3）漂浮苗鑒定可在一個月之內完成，使得提高煙苗密度、減少水培面積可行，從而大幅度減少接種菌的數量。

表4 漂浮苗接種、土壤盆栽接種與田間病圃接種的抗性

Table 4 The resistance comparison of three inoculation methods

注：HS（高感），S（感病），MS（中感），MR（中抗），R（抗病）。

漂浮苗接種鑒定方法的實用性在于：發病迅速，從接種到調查結束可在1個月內完成；占地面積小，在幾十平方米的面積上，一次可同時鑒定上千株煙苗；結果重復性高，能有效排除土壤溫度差異和其他病害對抗性結果的干擾，有利于年度間和不同實驗室間結果重現和比較；結果可靠性高，抗感品種的發病率和病情指數差異明顯，品種的抗性評價結果與他人多年的抗性評價結果基本一致。該方法在抗病資源和育種中間材料的抗性鑒定、抗性遺傳規律研究中應用潛力較大。

4 結 論

漂浮苗接種鑒定方法具有很強的實用性，具有省工節時、結果可靠等優點。其技術要點為：池底和池壁鋪保溫性能高的泡沫塑料板；設置池水加熱控溫棒、池水循環泵，使池水溫度穩定、均勻控制在黑脛病適宜發病的溫度28 ℃；在池水中加入黑脛病菌至濃度1×108cfu/mL；采用苗齡40 d 左右煙苗創傷接種法進行鑒定。

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[8] 任廣偉，孔凡玉，王鳳龍，等. GB/T 23222—2008 煙草病害分級及調查方法[S]. 北京：中國標準出版社出版，2008.

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A Float System Resistant Identification Method of Tobacco Black Shank

LI Meiyun, LIU Yong, XIAO Bingguang, LENG Xiaodong, LI Yongping

(Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Breeding Research Southern Center, Yuxi, Yunnan 653100)

Tobacco black shank is one of the most destructive diseases in tobacco. It is highly significance to establish an identification method on resistant of tobacco black shank using inoculation in a float seeding system. Pathogenicity determination was conducted and No 162 isolate was screened to study resistant identification of tobacco black shank disease. A resistant identification method in float seeding system was studied and the influence was analysized for different inoculation condition on identification results. The results showed that 40 d seedling inoculation, water temperature 28 ℃ and wound inoculation was fit to resistant identification and evaluation of tobacco varieties. Three inoculation methods (float system, pot experiment, and field nursery) were compared with regard to resistant identification. An identification method on resistant of tobacco black shank using inoculation in a float seeding system was established.

tobacco; black shank disease; resistant identification; float system

S572.08

1007-5119（2014）01-0076-04

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.014

中國煙草總公司資助項目（110201002001）；云南省科技廳資助項目（2012BB006）；云南省煙草公司計劃資助項目（05-06，2010YN02，2011YN06）

李梅云，女，碩士，副研究員，主要從事煙草病害研究。E-mail：630701256@qq.com

2012-08-24

2013-10-10