煙草T-DNA插入位點側翼序列擴增方法的篩選與優化

劉 慧，劉貫山，劉 峰，龔達平，張雪峰，崔萌萌，路鐵剛，王元英

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煙草T-DNA插入位點側翼序列擴增方法的篩選與優化

劉 慧1,3，劉貫山1，劉 峰2,3，龔達平1，張雪峰1,3，崔萌萌1，路鐵剛2，王元英1*

（1.中國農業科學院煙草研究所，中國農業科學院煙草遺傳改良與生物技術重點開放實驗室，青島 266101；2.中國農業科學院生物技術研究所，北京 100081；3中國農業科學院研究生院，北京 100081）

煙草T-DNA激活標簽插入突變體庫的創制過程中，需要進行大量的T-DNA插入位點的側翼序列擴增，因此選擇一種適用于煙草T-DNA側翼序列擴增的高效方法尤為必要。本研究比較了TAIL-PCR、PCR-walking、FPNI-PCR三種方法對T-DNA插入位點側翼序列的擴增效率、插入位點確定的比例和同源蛋白比對結果，并對3種方法的PCR程序、體系和引物設計等方面進行了優化，確定TAIL-PCR更適合煙草的側翼序列擴增，通過產率、條帶長度、插入位點和同源蛋白比對結果的比較，得出TAIL-PCR更適合煙草的側翼序列擴增。這一結果為應用煙草突變體開展煙草基因功能的研究奠定了基礎。

煙草；T-DNA；插入位點；側翼序列；篩選

目前，基因功能的研究已經成為分子生物學研究領域的重要課題。大規模突變體庫的建立是基因功能研究直接且行之有效的方法，目前水稻和擬南芥等重要模式植物已經成功建立了T-DNA插入突變體庫[1]。煙草作為重要模式植物之一，其基因結構和功能的研究對農業經濟和分子生物學研究都具有重要意義。建立煙草突變體庫是克隆和分析煙草重要功能基因的基礎和前提。

T-DNA激活標簽插入法是建立突變體庫的重要方法之一[2]，在煙草T-DNA激活標簽插入突變體創制過程中，對其側翼序列的擴增與分析就成為非常重要的研究內容。由于煙草T-DNA激活標簽插入突變體數量龐大，側翼序列的分離工作就比較耗時耗力，因此選擇一種高效的適用于分離煙草T-DNA激活標簽插入突變體側翼序列的方法，就為后面的工作提供了便利的條件。

TAIL-PCR（thermal asymmetric interlaced PCR）、PCR walking和FPNI-PCR（fusion primer and nested integrated PCR）都已經在水稻與園藝植物等其他植物中廣泛用于側翼序列的分離，本研究在比較這3種方法在煙草側翼序列擴增效率、插入位點確定的比例和同源蛋白比對結果的基礎上，分別對3種方法的程序、體系、引物設計進行了改進，以期獲得更高效的適用于煙草的側翼序列分離方法。

1 材料與方法

1.1 材料

2012年3月采集煙草T-DNA激活標簽插入突變體葉片，提取DNA，對樣品進行陽性轉化檢測，共得到T0代陽性轉化植株葉片DNA180份。

植物基因組提取試劑盒、TAKARA公司rTaq、ExTaq聚合酶、dNTPs、Transgene公司無菌水、DMSO、用于實驗的均為PAGE級合成引物、T4 Ligase、SspI內切酶、TBE 緩沖液、 EtBr和瓊脂糖。

1.2 方法

1.2.1 TAIL-PCR 根據載體pSKI015[3]的LB（left border）設計嵌套特異引物序列SP1、SP2、SP3（表1），使用LAD1、LAD3和AC1隨機簡并引物和載體特異引物SP1、SP2、SP3（表1）[4-5]，按照TAIL-PCR反應條件（表2）進行PCR擴增。

1.2.2 PCR–walking 根據接頭序列設計引物AP1，根據pSKI015載體LB設計PCR walking引物WP1，設計嵌套引物AP2，WP2（表3），進行嵌套PCR反應。

使用PCR walking接頭和載體序列特異引物進行反應，PCR反應條件為：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性30 s，34個循環；67 ℃退火30 s，34個循環；72 ℃延伸2 min，34個循環；最后72 ℃延伸10 min。第2輪PCR 反應條件同第1輪。

1.2.3 FPNI-PCR 使用簡并引物FP1-9和隨機引物FSP1與FSP2（表4）以及載體特異性引物（表1），在表5所列的反應條件下進行PCR擴增。并篩選擴增效率最高的FP（fusion primer）引物。第一輪PCR循環中，高嚴謹和低嚴謹性循環分別重復6次（經實驗驗證，在第一輪PCR中，在將循環數分別設置為4、5、6、7時，進行6個重復的高嚴謹性和低嚴謹性反應，擴增結果最好）。

表1 根據載體pSKI015設計的特異引物

表2 TAIL-PCR反應條件

表3 PCR walking 所用引物

表4 FPNI-PCR反應所用引物

注：N代表A/T/G/C；S代表C/G；W代表A/T。

表5 FPNI-PCR反應條件

2 結 果

2.1 優化前TAIL-PCR、PCR walking與FPNI-PCR擴增方法的比較

2.1.1 TAIL-PCR擴增結果 在本次T0代材料擴增中，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果如圖1，擴增條帶很少且不清晰，不能進行成功測序。

2.1.2 PCR-walking擴增結果 使用PCR walking擴增方法和接頭特異引物擴增結果的瓊脂糖凝膠電泳如圖2。擴增條帶比較清晰，測序結果好，擴增效率較高，但是條帶較小，很難在煙草基因組數據庫中確定插入位點。

圖1 優化前的TAIL-PCR擴增

注：M為DNA長度Marker；泳道1～16為不同T0側翼序列擴增。圖2、4、5、7同。

圖2 PCR walking結果

2.1.3 FPNI-PCR擴增結果 挑選4個DNA樣品（編號306、312、316、318），分別采用不同的引物進行PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果見圖3。由于引物FP1、FP2、FP7與FP8擴增條帶數量多于其他引物，所以選擇FP7引物對180份煙草突變體材料進行FPNI-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖4。

2.1.4 3種擴增方法的比較 將3種PCR方法獲得的陽性擴增條帶進行擴增比例、條帶長度和NCBI蛋白數據庫中比對結果的比較（表6）。

3種方法的側翼序列擴增比例在35%左右，但是PCR walking擴增得到的側翼序列較短，除去200 bp載體序列，在煙草數據庫中比對時搜索到的大多都是重復序列區，而無法準確判斷T-DNA的插入位點，而且PCR walking操作中的接頭連接與退火是反應成功的關鍵因素，如果接頭處理不好，很容易導致后續實驗完全失敗。FPNI-PCR擴增效率和數據庫比對結果和TAIL-PCR相似，條帶小于TAIL-PCR的，但是其整個反應過程需要時間為5~6 h，縮短了反應時間，且第一輪和第二輪之間不需要稀釋產物，大量減少了工作量，因此，在接下來的試驗中，需要對FPNI-PCR進行引物和反應條件的優化，以獲得更長的條帶。TAIL-PCR擴增條帶長，在煙草數據庫中比對后，容易區分是否插入到非重復序列區，因此對TAIL-PCR需要進行優化的是，要達到更高的擴增效率。

圖3 篩選FP1-FP9引物電泳結果

注：M為DNA長度Marker；泳道1~4、5~8、9~12、13~16、17~20、21~24、25~28、29~32與33~36分別是由引物FP1、FP2、FP3、FP4、FP5、FP6、FP7、FP8與FP9擴增的。

圖4 應用FP7引物進行的FPNI-PCR擴增

表6 3種方法的PCR結果的綜合比較

2.2 對TAIL-PCR和FPNI-PCR的優化

2.2.1 TAIL-PCR引物和反應條件的優化 重新根據載體pSKI015 LB，設計特異引物SP(1)、SP(2)與SP(3)（表1），沿LB向5’端移動150 bp設計引物，防止載體在遺傳重組過程中發生LB丟失，而影響側翼序列的擴增效率。重新選擇AD引物[5-6]，經過實驗，二、三輪反應中的退火溫度在65 ℃時擴增比例最高，使用上述引物和反應條件對煙草突變材料T0進行側翼序列擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果見圖5。TAIL-PCR引物和反應條件優化后與優化前相比，擴增條帶數量更多，測序不易出現雜合等現象，測序結果更加準確（見圖1、圖5）。

圖5 優化后的TAIL-PCR擴增

2.2.2 FPNI-PCR引物的優化 重新選擇簡并引物Fad1-7、Fad2-1、Fad2-7、Fad3-1與Fad3-7，使用特異引物SP(1)、SP(2)、SP(3)（表1）進行PCR擴增。同樣選用編號306、312、316、318 四個樣品分別采用不同引物進行擴增，表2中第三輪第二步循環數12設置為18（實驗證明，循環數設置為12、16、18、20時，18和20個循環的擴增效果相當，且高于12和16個循環），瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果見圖6。由圖6可見，Fad3-7引物擴增效果最好，所以選擇Fad3-7引物對180份T0代煙草突變體材料進行FPNI-PCR擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR結果見圖7，優化后的條帶長度更大，數目更多（見圖4、圖7）。

圖6 不同Fad引物擴增結果

注：M為DNA分子量Marker；泳道1~4、5~8、9~12、13~16與17~20分別是由引物Fad1-7、Fad2-1、Fad2-7、Fad3-1與Fad3-7擴增的。

圖7 使用 Fad3~7進行的FPNI-PCR擴增結果

2.2.3 優化后擴增方法的比較 對優化后的TAIL-PCR和FPNI-PCR擴增得到的側翼序列進行擴增比例、條帶長度和NCBI蛋白數據庫搜索結果的比較（表7）。

改進后的兩種PCR方法在擴增比例上都有了提高，但是FPNI-PCR擴增的條帶長度較TAIL-PCR仍然較短。TAIL-PCR擴增得到的側翼序列有90.2%在煙草二倍體數據中確定了插入位點，79.7%在NCBI蛋白數據庫搜索到同源蛋白序列。優化后的TAIL-PCR擴增得到的側翼序列在確定插入位點和比對同源蛋白序列方面都較FPNI-PCR取得更好的結果。

表7 優化后TAIL-PCR和FPNI-PCR結果比較

3 討 論

TAIL-PCR 解鏈溫度大于65 ℃，任意簡并引物AD（arbitrary degenerate）解鏈溫度45 ℃，這樣可以通過熱不對稱的方法提高目標序列和抑制非目標序列的產生。TAIL-PCR包括三輪PCR反應，第一輪反應中，通過SP1對目標序列的10個循環的擴增后，提高目標分子的拷貝數，再進行一個低退火溫度的單循環（退火溫度為25 ℃），引物的高度簡并性和低退火溫度讓AD引物和目標序列以更高的概率結合，因此有效地為第二、三輪反應產生目標序列創造了一個或更多個退火位點。然后用嵌套特異引物LB2、LB3與AD引物進行二、三輪PCR反應，高效地產生靶序列[6-7]。而且上一輪PCR產物的稀釋，使得非目標序列的產量更低。

PCR-walking是通過已知T-DNA序列探知未知序列的方法，通過平末端限制性內切酶在T-DNA插入基因組附近產生平末端，將預先設計好的接頭引物（AP）與其連接，根據載體序列設計嵌套特異引物（WP）進行PCR步移，獲得T-DNA插入的側翼序列。由于接頭序列的應用，3’端的氨基封閉抑制非特異性產物擴增，PCR擴增產物均在接頭和T-DNA區域之間[8-10]。

FPNI-PCR需要三輪PCR反應，原理與TAIL-PCR相同，根據載體序列設計三個特異引物，在第一輪中，同樣運用熱不對稱原理。包括兩個高嚴謹性循環和一個低嚴謹性循環，高嚴謹性循環中產生目標序列單鏈DNA，在后面的低嚴謹性循環中應用FP（fusion primer）引物產生雙鏈DNA。3~6個上述循環后，形成部分目標序列，同時伴隨著非目標序列的產生，在第二、三輪PCR循環中，應用高嚴謹性循環，因此，目標特異序列得到選擇性擴增。由于特異嵌套引物，非目標序列得不到大量擴增，而且，非目標序列中的發卡結構抑制其擴增。FPNI-PCR中通用引物是在一段15~16個堿基的簡并序列的5’端連接有一段具有發夾結構的核苷酸序列，形成融合引物，應用于第一輪PCR反應中，最大的特點是簡并序列和發卡結構序列融合在一起，因此，可以抑制在反應中產生的非目標序列，由于其發卡結構存在而不能繼續合成雙鏈DNA[11-12]。FPNI-PCR中區別于TAIL-PCR的最大特點是融合引物（表3）。

4 結 論

TAIL-PCR是在1995年發表的用于擴增側翼序列的有效方法[7]，并在2007年進行了PCR溫度條件、通用引物設計與應用AD引物池等方面的改進，使得擴增條帶長度和產率有了大幅提高[4]。本實驗在應用TAIL-PCR擴增側翼序列時，得到的片段都在1~3 kb，在煙草基因組數據庫中比對時，由于其條帶長度較大，可以區別是否插入到重復序列區，在NCBI數據庫中比對得到了較多的同源蛋白序列，是比較適合煙草的側翼序列的擴增方法。相比較而言，PCR-walking獲得的條帶在400 bp左右，其中200~300 bp為載體序列，在煙草數據庫中比對時容易搜索到重復序列區。FPNI-PCR由于其原理與TAIL-PCR方法相同，雖然擴增比例較高，但是條帶長度不大，情況和PCR walking相似，很難在煙草基因組數據庫中確定T-DNA的插入位點。

因此，在T-DNA插入煙草突變體側翼序列擴增中，使用TAIL-PCR能產生較高的側翼序列產率，插入位點確定比例更高，并且側翼序列能在NCBI nr數據庫中比對到更多的同源蛋白序列。TAIL-PCR在T-DNA側翼序列擴增效率和蛋白數據庫中比對同源蛋白序列的結果，相對與其他兩種方法都更適合煙草的T-DNA側翼序列擴增。

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The Screening and Optimization of Three Methods to Clone the Flanking Sequences of Transgenic Tobacco

LIU Hui1,3, LIU Guanshan1, LIU Feng2,3, GONG Daping1, ZHANG Xuefeng1,3, CUI Mengmeng1, LU Tiegang2, WANG Yuanying1*

(1. Tobacco Research Institute of CAAS, Key Laboratory of Tobacco Genetic Improvement and Biotechnology, CAAS, Qingdao 266101, China; 2. Biotechnology Research Institute of CAAS, Beijing 100081, China; 3. Graduate School of CAAS, Beijing 100081, China)

As the mutant pool of T-DNA insertion has been constructed, a quantity of T-DNA flanking sequences are in great need to be cloned. TAIL-PCR, PCR-walking and FPNI-PCR have been used to clone the sequences flanked by known sequences. For this reason, it will be great help to choose an efficient method applied to the analysis of the tobacco T-DNA insertion flanking sequences. This study focus on the comparison among the efficiency, T-DNA insertion localization and the researched homologous protein of the three methods, also we optimized the PCR procedures and primers to select an effective method which is suitable for cloning of tobacco T-DNA flanking sequences. By comparing the efficiency, T-DNA insertion localization and the researched homologous protein, the result of TAIL-PCR was the best. This result lays a foundation for the study on tobacco gene function by using mutant.

tobacco; T-DNA; insertion site; flanking sequence; screen

TS413

1007-5119（2014）01-0096-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2014.01.018

中國煙草總公司煙草基因組計劃重大專項項目“煙草突變體庫創制、篩選與分析”[110201101009（JY-03）]；“煙草突變體篩選與鑒定” [110201201004（JY-04）]；“煙草全基因組過表達和RNA干涉體系構建”（110200902036）

劉 慧，女，在讀碩士，研究方向為煙草分子育種。E-mail：liuhui20062988@126.com。

通信作者，E-mail：wyytob@126.com

2013-01-08

2013-06-19