微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型的建立與染色方法的比較*

郭倩倩，張鵬飛，王琳，孔靜，張運，張梅

(山東大學齊魯醫院心內科，山東濟南 250012)

·實驗技術·

微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型的建立與染色方法的比較*

郭倩倩，張鵬飛△，王琳，孔靜，張運，張梅

(山東大學齊魯醫院心內科，山東濟南 250012)

目的:建立微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型，并比較茜素紅S和馮·科薩染色方法對微鈣化的識別。方法：30只雄性新西蘭兔，在高脂飼料喂養和腹主動脈內皮球囊損傷基礎上，隨機分為套管組(給予腹主動脈雙楔形套管縮窄)和非套管組，喂養12周，對比茜素紅S和馮·科薩染色方法對微鈣化識別的價值，并比較兩組微鈣化的發生率。結果:兩組均形成動脈粥樣硬化斑塊，套管組微鈣化發生率和鈣化面積高于非套管組(P＜0.05)。茜素紅S和馮·科薩染色識別微鈣化的敏感性相同，前者具有熒光活性的優勢，但對于微鈣化的定位準確性遜于后者。結論:本研究成功建立了一種微鈣化動脈粥樣硬化斑塊兔模型。茜素紅S和馮·科薩染色均能較好識別微鈣化。

微鈣化;動脈粥樣硬化;茜素紅S染色;馮·科薩染色;模型，動物

在動脈粥樣硬化斑塊的發展過程中會出現鈣質沉積。鈣化對動脈粥樣硬化斑塊穩定性的作用一直存在爭議。有限元函數分析發現，鈣化并不增加斑塊纖維帽處的局部應力，對斑塊的力學穩定性沒有影響［1-2］。而近期有學者發現斑塊表面的鈣化結節，特別是直徑在10 μm以下的微鈣化能增加斑塊易損性，促使斑塊破裂［3-6］。但由于缺乏微鈣化動脈粥樣硬化斑塊動物模型和敏感的病理學染色技術，對微鈣化與斑塊穩定性間關系的研究有限。

兔腹主動脈內皮機械性損傷加高脂飼料喂養是復制動脈粥樣硬化斑塊常用的動物模型，尤其適用于介入性診療技術的研究。但該模型所形成的斑塊以脂質和膠原成分為主，尚未見有微鈣化成分的報道［7-10］。業已證實，血流剪切力的變化不僅參與動脈粥樣硬化的發生［11］，還與斑塊內鈣化密切相關［12］。Cheng等［13］在體外實驗中證實，利用符合流體力學原理的套管可同時模擬不同形式的剪切力。故本研究擬在腹主動脈內皮球囊損傷加高脂飼料喂養的傳統模型基礎上引入腹主動脈套管縮窄，改變局部的血流剪切力，以期建立微鈣化動脈粥樣硬化斑塊動物模型;并利用此模型對比茜素紅S(alizarin red S)和馮·科薩(von Kossa)這2種常用的鈣質染色技術用于微鈣化染色的可行性和異同點。

材料和方法

1 動物與模型建立

雄性純種新西蘭兔30只，體重1.5～2.5 kg(購自山東省農業科學院，合格證號為魯動質字D20021135)。隨機分為套管組和非套管組，每組各15只，均給予2%高膽固醇飼料喂養12周，并按課題組前期發表的方法［7］，于第1周末，經股動脈入路，以充盈球囊反復損傷腹主動脈內膜3次。在套管組，球囊損傷操作結束后，開腹，于右腎動脈開口下方2 cm處分離腹主動脈并置入硅膠材質的雙楔形套管，見圖1。

2 血流剪切力檢測

在球囊損傷操作前和第12周末利用超聲(GE公司Vivid q彩色超聲儀，探頭8L-RS，頻率4.0～13.0 MHz)對套管組近心端、套管內最狹窄處、套管遠心端部位的腹主動脈和非套管組相應部位的腹主動脈進行長軸和橫切面掃查，分別測量舒張末期內徑(diastolic diameter，Dd)和平均血流速度(mean flow velocity，Vm)。同時自兔耳緣靜脈抽血，于2 h內完成血液黏滯度(η)測定(中外合資北京中勤世帝公司LG-R-80全自動流變儀)，并按下述公式計算血流剪切力(fluid shear stress，τm):τm=η×4×Vm/ Dd。

3 取材

第12周末，實驗動物麻醉成功后開腹，分離腹主動脈全長，隨后經耳緣靜脈注射過量3%戊巴比妥鈉安樂死處死動物，并立即將灌注針插入右腎動脈開口水平稍下方的腹主動脈腔內，下腔靜脈剪小口，以4%多聚甲醛行腹主動脈局部灌注固定。取套管近心端、套管內及遠心端的腹主動脈，修剪成2mm長的小塊后至于預冷的4%多聚甲醛中，4℃下充分固定48 h;在非套管組，則取對應于套管組套管近心端至套管遠心端之間的腹主動脈為樣本。

4 常規病理學及免疫組織化學染色

固定后的腹主動脈，分別進行石蠟和冰凍包埋，以5 μm厚度制片，行HE、天狼星紅、油紅O染色和抗β-肌動蛋白(武漢博士德生物工程有限公司)、抗巨噬細胞(monoclonal mouse anti-rabbit macrophage，clone RAM11;Dako)免疫組織化學染色以顯示斑塊內的膠原纖維、脂質、平滑肌成分和巨噬細胞的浸潤。

5 微鈣化染色

連續2張石蠟切片分別行茜素紅S染色和馮·科薩染色。

5.1 茜素紅S染色石蠟切片常規脫蠟后置入0.5%茜素紅S溶液30 min，蒸餾水速洗3次，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，環保樹膠封片。

5.2 馮·科薩染色石蠟切片常規脫蠟后置入1% AgNO3溶液，紫外線下照射30 min，蒸餾水速洗3次，加入5%硫代硫酸鈉5 min去除未反應的銀，蒸餾水速洗3次后加入0.1%核固紅溶液1 min復染細胞核，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，環保樹膠封片。

6 微鈣化的觀察與分析

茜素紅S和馮·科薩染色的切片，先后在激光共聚焦顯微鏡(ZEISS LSM 710)和光學顯微鏡(Leica DM2500)下觀察。在60倍光學顯微鏡下選取相同視野拍照，以Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件計算鈣化面積占斑塊面積的百分比。

7 統計學處理

采用SPSS 17.0軟件分析。計量數據以均數±標準差(mean±SD)表示。兩組間比較采用t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析。計數資料采用Fisher精確檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

套管組因手術意外死亡3只，術后腹瀉死亡3只，2組分別有9和15只完成實驗。

12 組間血流剪切力的比較

非套管組兔球囊損傷操作前與12周末腹主動脈血流剪切力間無顯著差異［(33.19±3.30)dyn/cm2vs(27.86±4.17)dyn/cm2，P＞0.05］。而套管組，12周末時套管近心端的剪切力顯著低于球囊損傷操作前，構建出低剪切力模型;套管內的剪切力明顯高于球囊損傷操作前，構建出高剪切力模型;而套管遠心端的剪切力顯著低于球囊損傷操作前且彩色多普勒超聲顯示紊亂的血流圖像，提示存在振蕩剪切力，見圖2、表1。

Figure 2.Color Doppler ultrasonography of the cast-placement group before surgery(A)and 12 weeks after surgery (B).圖2 套管組術前(A)術后(B)血流圖

表1 套管組術前、術后各部位血流剪切力的比較Table 1.Comparison of the shear stress between pre-and postsurgery in the group with the abdominal cast(dyn/cm2.Mean±SD)

22 組間動脈粥樣硬化斑塊組成成份的比較

12周末非套管組和套管組近心端、遠心端處腹主動脈均發現動脈粥樣硬化斑塊形成。病理學染色結果表明套管組近心端和遠心端巨噬細胞、膠原纖維的含量均顯著高于非套管組，而平滑肌細胞、脂質含量與非套管組無統計學差異;套管組近心端與遠心端各種組織含量間無顯著差異，見圖3。

Figure 3.Comparison of different components in the atherosclerotic plaques between non-cast-placement and cast-placement groups at the 12th week.Histological changes of the abdominal aortas were observed(HE staining)，and the atherosclerotic plaques were stained for macrophages(anti-RAM11)，vascular smooth muscle cells(VSMCs;anti-β-actin)，collagen(Sirius red staining)or lipids(oil red O staining).Scale bar=20 μm.Mean±SD.*P＜0.05 vs non-cast-placement group.圖3 2組間動脈粥樣硬化斑塊組成成份的比較

32 組間微鈣化發生率的比較

非套管組只有1只兔的1個部位發生微鈣化，鈣化面積為0.12%;而套管組中有4只兔共計10個部位發生微鈣化，均位于套管近心端和遠心端，鈣化面積平均為0.27%。套管內高剪切力區域未發現微鈣化。2組的鈣化率有顯著差異(P＜0.05)，見圖4。

42 種染色方法對微鈣化的識別比較

4.1 普通光學顯微鏡下觀察結果2種染色方法均可識別斑塊內微鈣化，且2種染色方法測得的鈣化面積并無顯著差異(P＞0.05)，見圖5。

Figure 5.Comparison of the calcification area index measured by alizarin red S and von Kossa staining.Mean±SD.n= 5.圖5 2種染色方法測得的鈣化面積比較

馮·科薩染色下，微鈣化為黑灰色或黑色，細胞核為粉紅色，細胞輪廓清楚，組織結構清晰，60倍鏡下可分辨出細胞內鈣化與細胞外基質鈣化，見圖6B、D。茜素紅S染色技術將鈣化染為粉紅或紅色，但由于該技術不能復染細胞核，細胞輪廓不清晰，鈣化部位定位不準確，見圖6A、C。

Figure 6.Microcalcification stained by alizarin red S(A，C)and von Kossa(B，D).Microcalcification was black or black-grey signals under von Kossa staining whereas vivid red signals under alizarin red S staining.Both cellular(blue arrow)and extracellular(green arrow) microcalcification could be observed with von Kossa straining.Black arrow points to the nucleus.Scale bars represent 100 μm in A and B，and 20 μm in C and D.圖6 光學顯微鏡下觀察微鈣化

4.2 激光共聚焦顯微鏡下觀察結果茜素紅S染色的切片在共聚焦圖片中，背景的自發熒光可忽略，陽性信號為紅色，對比鮮明，見圖7A。在本研究建立的動物模型中可見球形和長條形2種形態的微鈣化，直徑范圍自1～15 μm不等，見圖7B、C。馮·科薩染色無熒光活性，無法在激光共聚焦掃描顯微鏡下成像觀察。

討論

動脈粥樣硬化斑塊破裂和繼發血栓形成是急性心血管事件的主要病因。在動脈粥樣硬化發展過程中伴隨著鈣化的發生:早期，平滑肌細胞、巨噬細胞的凋亡與壞死可導致細胞水平或亞細胞水平的微鈣化;中晚期，脂質核心形成，在壞死區域可出現較大的鈣化顆粒，最終可發生骨化。鈣化對動脈粥樣硬化斑塊穩定性的影響愈發受到關注。Vengrenyuk等［3］利用Goodier數學模型證實薄纖維帽處的微鈣化可使其周圍的應力加倍，引起界面的分離，導致斑塊破裂。Bluestein等［4］利用流固耦合(fluid-structure interaction，FSI)模型提出微鈣化能增加局部應力并導致斑塊破裂的理論假說。但由于缺少適宜的微鈣化動脈粥樣硬化斑塊動物模型及可識別微鈣化的病理學染色方法，這些理論模型的體內驗證研究受到限制。

Figure 7.Microcalcification observed under laser scanning confocal microscope.Microcalcification was shown as vivid red signals in two-dimensional image(A).Spherical and rectangular microcalcification could be illustrated with three-dimensional reconstructed images(B and C).Cartoons inserted at the right upper corner of each image demonstrated the location of the microcalcification within the atherosclerotic plaque.The blue area represents the plaque.Red spots represent microcalcification.圖7 激光共聚焦顯微鏡觀察微鈣化

傳統的高脂飼料喂養加腹主動脈內皮球囊損傷的兔模型中，可見斑塊內富含脂質、膠原，炎性細胞浸潤亦可在該類動物模型中得以復制，但鈣化發生較少［7-10］。本研究證實，腹主動脈套管縮窄導致血流剪切力的改變，而剪切力與鈣化發生密切相關。Stefan等［12］通過血管內超聲及虛擬組織顯像技術分析冠狀動脈分支處斑塊負荷及組織成份，發現在分支的對側壁，即一般認為的低剪切力區，斑塊負荷大且鈣化嚴重。本實驗結果與之相符，套管近心端與遠心端為低剪切力區且微鈣化發生明顯增加。同時，本研究證實振蕩剪切力促進微鈣化的發生，這在文獻中鮮有報道。本實驗結果表明在傳統模型存在的高脂環境和內皮炎癥基礎上，剪切力導致斑塊內微鈣化發生率增加，成功建立了一種適合研究微鈣化動脈粥樣硬化斑塊的動物模型。

茜素紅S和馮·科薩是常用的鈣質染色技術。茜素紅S通過結構中的硫酸基團及羥基基團與鈣離子反應形成粉紅色或紅色鈣鹽［14］。茜素紅S染料可自發紅色熒光，呈色反應可借助激光共聚焦顯微鏡觀察［3］。馮·科薩染色利用硝酸銀溶液與鈣鹽的磷酸根或碳酸根反應生成相應的磷酸銀或碳酸銀，后者可被日光或者紫外線還原為黑灰或黑色的金屬銀［14］。本研究證實2種方法同樣適用于微鈣化染色，對微鈣化的敏感性相同。馮·科薩染色顏色對比鮮明，組織細胞結構清楚，能明確微鈣化發生于細胞內或細胞外基質。茜素紅S是一種陰離子蒽醌類染料，具有自發熒光，可通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察，利用其在深度識別能力(最大深度為200～400 μm)和縱向分辨率的優勢，進行三維重建，靈活、直觀地顯示微鈣化的空間形態［15］，且茜素紅S的熒光活性可用于流式細胞術等技術，對細胞、分子水平的研究提供便利，但茜素紅S染色不能準確顯示細胞核，對于鈣化位置的定位有一定的局限性。鑒于微鈣化的位置及形狀對斑塊穩定性有各異的作用［3，5］，2種染色技術的聯合應用對于全面分析微鈣化與斑塊穩定性間的關系更具價值。

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Development of a New Zealand rabbit model of microcalcified atherosclerotic plaques and comparison of staining methods for determining microcalcification

GUO Qian-qian，ZHANG Peng-fei，WANG Lin，KONG Jing，ZHANG Yun，ZHANG Mei
(Department of Cardiology，Qilu Hospital of Shandong University，Jinan 250012，China.E-mail:pengf-zhang@163.com)

AIM:To develop a New Zealand rabbit model of microcalcified atherosclerotic plaques and to compare alizarin red S staining and von Kossa staining for identifying the microcalcification.METHODS:Thirty New Zealand rabbits were randomly divided into cast-placement group and non-cast-placement group.All animals were fed with high-cholesterol diets and underwent aortic endothelial denudation.Double-wedge-shaped casts were implanted around the aorta in the animals in cast-placement group.At the end of the 12th week，the rabbits were sacrificed and the arterial samples were collected to stain the possible microcalcification within the plaques by the techniques of alizarin red S staining and von Kossa staining.RESULTS:Atherosclerotic plaques were found in abdominal aorta in both groups.Microcalcification was evidenced more frequently in cast-placement group，and the calcification area index was also much larger.The alizarin red S staining and von Kossa staining had similar sensitivity for identifying microcalcification.The von Kossa staining was superior to illuminate the accurate localization of the microcalcification，while the alizarin red S staining held the benefit of fluorescence.CONCLUSION:A new animal model of microcalcified atherosclerotic plaques is developed successfully.Both alizarin red S staining and von Kossa staining could be used to identify microcalcification sensitively.

Microcalcification;Atherosclerosis;Alizarin red S staining;von Kossa staining;Models，animal

R541.4

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2014.02.034

1000-4718(2014)02-0374-06

2013-09-16

2013-12-14

國家重點基礎研究計劃(973)項目(No.2010CB732605);國家自然科學基金資助項目(No.30972809)

△通訊作者Tel:0531-82169429;E-mail:pengf-zhang@163.com