“泡”實驗室 攻世界難題（一）
——中國青年女科學(xué)家顏寧教授博文及有關(guān)資料選編

本刊編輯部

（上海交通大學(xué)，上海 200030）

1 掀開了新篇章

今年6月，我們研究組在Nature上發(fā)表了題為“Crystal structure of the human glucose transporter GLUT1”的論文，在世界上首次報道了人源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)，初步揭示其工作機制以及相關(guān)疾病的致病機理，在國際上影響較大，現(xiàn)在先對研究課題內(nèi)容及情況做些介紹。

（1）葡萄糖（D-glucose）是地球上包括從細菌到人類各種生物已知最重要、最基本的能量來源，也是人腦和神經(jīng)系統(tǒng)最主要的供能物質(zhì);據(jù)估算，大腦平均每天消耗約120g葡萄糖，占人體葡萄糖總消耗量的一半以上。葡萄糖代謝的第一步就是進入細胞：親水的葡萄糖不能自由穿透疏水的細胞膜，其進出細胞需要通過鑲嵌于細胞膜上的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白完成。其中一類屬于主要協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白超家族（Major Facilitator Superfamily，簡稱MFS）的轉(zhuǎn)運蛋白，它是大腦、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉、紅細胞等組織器官中最重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白（glucose transporters，簡稱GLUTs）。在人體的14個GLUTs中，GLUT1、2、3、4 這四種蛋白生理功能最重要，研究最廣泛，其中GLUT1（圖1）因發(fā)現(xiàn)最早而得名。

圖1 人源葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)

GLUT1幾乎存在于人體每一個細胞中，是紅細胞和血腦屏障等上皮細胞的主要葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白，對于維持血糖濃度的穩(wěn)定和大腦供能起關(guān)鍵作用。在已知的人類遺傳疾病中，導(dǎo)致GLUT1功能異常的突變會影響葡萄糖的正常吸收，導(dǎo)致大腦 萎縮、智力低下、發(fā)育遲緩、癲癇等一系列的疾?。℅LUT1 Deficiency syndrome，又稱De Vivo syndrome）。另一方面，當(dāng)發(fā)生癌變時，葡萄糖是腫瘤細胞最主要的能量來源，但是腫瘤細胞由于缺乏氧氣供應(yīng)而只能對葡萄糖進行無氧代謝，同質(zhì)量葡萄糖所提供的能量不到正常細胞的10%，因而對葡萄糖的需求劇增（這是被稱為Warburg Effect的腫瘤細胞代謝現(xiàn)象），在很多種類的腫瘤細胞中都觀察到GLUT1的超量表達，以大量攝入葡萄糖維持腫瘤細胞的生長擴增，這使得GLUT1的表達量可能作為檢測癌變的一個指標。

（2）葡萄糖跨膜轉(zhuǎn)運的研究歷史基本上代表了人類理解物質(zhì)跨膜運輸?shù)臍v史。將近100年前，就觀測到紅細胞對葡萄糖的飽和性吸收;起初認為葡萄糖是通過自由跨膜擴散進入細胞的，隨著實驗證據(jù)的積累，1948年，LeFevre等首次提出葡萄糖的進入紅細胞的跨膜擴散需要細胞膜上的特定組分（蛋白質(zhì)）參與;1952年，Widdas等通過對人體紅細胞轉(zhuǎn)運葡萄糖的動力學(xué)研究提出了飽和運載體機制（saturable carrier mechanism），理論上揭示了細胞膜上運載體（carrier）的存在（盡管之后的研究并不再支持這轉(zhuǎn)運模型，但至今許多跨膜轉(zhuǎn)運蛋白仍然以carrier命名，轉(zhuǎn)運蛋白家族以SLC分類）;1977年，Kasahara和Hinkle從人體紅細胞提純分離出了參與葡萄糖轉(zhuǎn)運的膜蛋白，并實現(xiàn)了脂質(zhì)體重構(gòu)功能實驗，證實了葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白的存在;1985年，Harvey Lodish實驗室首次鑒定出了人體GLUT1蛋白的基因序列，并根據(jù)氨基酸序列預(yù)測了其具有12次跨膜區(qū)的拓撲結(jié)構(gòu);1991年，De Vivo等首次報道了與GLUT1突變體相關(guān)的疾病癥狀，并將這一大類與GLUT1突變相關(guān)的疾病命名為De Vivo綜合癥，展示了GLUT1與人類健康的緊密關(guān)聯(lián)。

自從獲得了大量生理、病理、細胞、生化信息之后，獲取GLUT1的三維結(jié)構(gòu)就變成了該領(lǐng)域最期待的下一個突破。為了結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，科學(xué)家嘗試了從紅細胞中、動物組織中直接提取GLUT1或者通過重組表達的方法獲取;同時還嘗試通過研究GLUT1-4的同源蛋白結(jié)構(gòu)信息來間接理解這些重要的人源轉(zhuǎn)運蛋白。上個世紀80年代，Henderson等報道了數(shù)個與GLUT具有序列同源性的細菌糖轉(zhuǎn)運蛋白;90年代，一系列工作報道了GLUT1蛋白在多種表達體系中的重組表達;真正的結(jié)構(gòu)生物學(xué)突破發(fā)生于2012年，我們研究組首次解析了GLUTs的大腸桿菌同源蛋白XylE與葡萄糖結(jié)合的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，并利用同源建模預(yù)測了GLUT1-4的三維結(jié)構(gòu);現(xiàn)在，人源GLUT1蛋白的晶體結(jié)構(gòu)的捕獲為我們理解這個具有歷史研究意義的轉(zhuǎn)運蛋白掀開了新的篇章。

2 培養(yǎng)隊伍持之以恒

我們研究組所以能夠在激烈的國際競爭中率先解析GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)源于我們這些年來對于MFS家族的深入理解和研究積淀。我們實驗室在2007年成立之日就將GLUTs作為主要研究對象，然而作為結(jié)構(gòu)生物學(xué)領(lǐng)域最為困難的膜蛋白、尤其是真核膜蛋白的研究，首先要培養(yǎng)一支研究隊伍。我們從相對簡單的細菌同源蛋白開始著手，邊培養(yǎng)學(xué)生邊積累經(jīng)驗教訓(xùn)，2010年解析了大腸桿菌中巖藻糖轉(zhuǎn)運蛋白FucP的晶體結(jié)構(gòu)（Dang et al，Nature，2010），2012年解析木糖轉(zhuǎn)運蛋白XylE的晶體結(jié)構(gòu)（Sun et al，Nature，2012）。在研究這些同家族糖轉(zhuǎn)運蛋白的結(jié)構(gòu)與機理過程中，對于 MFS家族的工作機理有了深入了解，分析出GLUT1結(jié)晶的瓶頸在于高度動態(tài)、結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定。針對這一問題，我們著手尋找可以將GLUT1鎖定于某一構(gòu)象的致病突變體，同時利用低溫結(jié)晶進一步穩(wěn)定蛋白構(gòu)象，終于克服了GLUT1重組表達、純化結(jié)晶的一系列技術(shù)障礙，我們終于獲得了GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)（圖2）。

GLUT1的三維晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)經(jīng)典的MFS家族折疊方式——12個跨膜螺旋組成N端和C端兩個結(jié)構(gòu)域。兩個結(jié)構(gòu)域之間的腔孔朝向胞內(nèi)區(qū)，即該結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)向內(nèi)開放構(gòu)象。而在結(jié)晶中用到的去污劑頭部恰好是葡萄糖苷，其結(jié)合位點與此前XylE中觀測到的葡萄糖結(jié)合位點基本重合，證實了MFS家族具有單一結(jié)合位點。有趣的是，GLUT1在胞內(nèi)可溶區(qū)還具有一個由4個α螺旋組成的結(jié)構(gòu)域（簡稱ICH），這一序列只在MFS中的糖轉(zhuǎn)運蛋白亞家族中（Sugar Porter subfamily）觀察到，因此ICH是屬于該家族蛋白的特有結(jié)構(gòu)特征。利用GLUT1的晶體結(jié)構(gòu)可以精確地定位與疾病相關(guān)的突變氨基酸，揭示其致病機理。分析顯示，30余個突變氨基酸基本集中于3個區(qū)域：底物結(jié)合區(qū)域、胞外門控區(qū)、胞內(nèi)門控區(qū)，它們的突變或者影響了底物識別，或者影響轉(zhuǎn)運蛋白的構(gòu)象變化。晶體結(jié)構(gòu)使得理解這些致病突變的機理一目了然。與之前獲得的向胞外半開口的XylE晶體結(jié)構(gòu)比較揭示出ICH在GLUT1的構(gòu)象變化中起關(guān)鍵作用。鑒于ICH在糖轉(zhuǎn)運蛋白亞家族的保守性，這一發(fā)現(xiàn)可能適用于該亞家族所有成員。

至此，我們實驗室一個接一個分別捕獲了FucP向胞外開放，XylE結(jié)合底物半開放，GLUT1向胞內(nèi)開放的3個MFS家族最具有代表性的轉(zhuǎn)運狀態(tài)結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)比對初步揭示出MFS糖轉(zhuǎn)運蛋白在轉(zhuǎn)運循環(huán)中的構(gòu)象變化，對于理解MFS家族糖轉(zhuǎn)運蛋白的轉(zhuǎn)運過程提供了重要的分子基礎(chǔ)。

我們研究組（圖3）是一個比較年輕的團隊，我本人屬于“70后”，這項研究成果的第一作者鄧東博士屬于“80后”，是PTN（北京大學(xué)、清華大學(xué)和北京生命科學(xué)研究所聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生項目）的第一位畢業(yè)生，其博士階段針對TAL effector特異識別DNA分子機制的研究曾經(jīng)入選2012年Science評選的年度十大進展及2012年度中國科學(xué)十大進展。目前鄧東為清華-北大生命科學(xué)聯(lián)合中心（CLS）的博士后;共同第一作者徐超和吳建平屬于“90后”，2012年于清華大學(xué)生命學(xué)院獲得本科學(xué)位后加入CLS博士研究生項目，目前為博士二年級;共同第一作者孫鵬程來自生命學(xué)院01班，于大二暑假加入到我的實驗室，即開始參與GLUT1的結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，目前已被CLS錄取，將于今年9月正式成為CLS的博士研究生。此外，本科來自于化生基科班、現(xiàn)為生命學(xué)院五年級博士研究生的閆創(chuàng)業(yè)和本科來自于數(shù)理基科班、現(xiàn)為CLS一年級博士生的胡名旭也對本工作做出了重要貢獻。

圖3 課題組部分成員

另外，我們團隊的此項工作獲得了自然科學(xué)基金委、科技部、CLS的經(jīng)費支持。我本人自2012年起受到國家自然科學(xué)基金委杰出青年基金和HHMI國際青年科學(xué)家項目資助、2013年獲得青年拔尖人才計劃資助。特別值得一提的是，上海同步輻射光源（SSRF）為及時收集高質(zhì)量衍射數(shù)據(jù)提供了必不可少的保障。這些都是我們團隊取得成功的基本條件。