利用斑馬魚成魚建立致幻類化合物行為評價(jià)模型

顏 慧，蘇瑞斌，宮澤輝

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所，北京 100850）

斑馬魚是一種小型亞熱帶淡水魚，因體側(cè)有銀藍(lán)色的縱向條紋而得名。斑馬魚具有近似人類的各種器官系統(tǒng)，如心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)，與人類的基因組保守性很高，人類的很多基因已經(jīng)在斑馬魚中克隆得到，而且具有相似的功能，斑馬魚作為一種新型的模式生物已廣泛用于研究脊椎動物的胚胎發(fā)育，近年來隨著研究的深入，斑馬魚在疾病研究、藥物篩選及毒性試驗(yàn)中的作用也逐漸引起關(guān)注［1-3］。

藥物濫用一直是世界性難題，而致幻劑在公共場所濫用現(xiàn)象近些年日趨嚴(yán)重。致幻劑是一類能引起意識改變，產(chǎn)生錯覺和幻覺、情感改變等類似急性精神病并導(dǎo)致嚴(yán)重的行為

紊亂的精神活性物質(zhì)，致幻劑引發(fā)的神經(jīng)精神障礙及機(jī)制至今尚未得到完全確證，有些作用機(jī)制明顯不同的化合物均能引起攝入者的幻覺。而成年斑馬魚對于環(huán)境變化與化合物干擾極為敏感，會產(chǎn)生相應(yīng)的復(fù)雜行為變化，近幾年本實(shí)驗(yàn)室針對斑馬魚的復(fù)雜行為表現(xiàn)建立了多種行為評測方法［4-5］，本文選擇甲基苯丙胺及氯胺酮作為致幻化合物，利用斑馬魚多個行為表現(xiàn)對其致幻性進(jìn)行了評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 動物 成年3～6個月斑馬魚，AB品系，♀♂比約為1∶1，在本實(shí)驗(yàn)室利用斑馬魚獨(dú)立養(yǎng)殖單元進(jìn)行培養(yǎng)，每6～8條置于3 L水箱中。魚水由純凈水添加海鹽配制而成。室溫與水溫控制在（28±2）℃，光照自動控制（光照時間8∶00～18∶00），正常喂食，每天兩次。所有的受試魚均為首次實(shí)驗(yàn)，且不重復(fù)使用，在受試前24 h禁食。

1.2 化合物 甲基苯丙胺（methamphetamine，METH），軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院楊征教授惠贈，以魚水配制成10 g·L-1儲備液；鹽酸氯胺酮（ketamine），購自 Sigma公司，CAS號：1867-66-9，以魚水配制成100 g·L-1儲備液。

1.3 儀器 斑馬魚獨(dú)立養(yǎng)殖單元ESEN-AW-SS-1（北京愛生科技發(fā)展有限公司）；斑馬魚游泳行為視頻跟蹤分析系統(tǒng)Zebralab 3.0、成魚行為觀測箱ZebraCube（法國Viewpoint公司）。

1.4 動物分組與藥物處理 斑馬魚分為4組：正常組（斑馬魚在1 L魚水中暴露30 min后，進(jìn)入含干凈魚水的測試箱中檢測）；甲基苯丙胺組（處理方式同正常組，魚在同體積2 mg·L-1甲基苯丙胺的水體中暴露30 min）；氯胺酮組（處理方式同正常組，魚在同體積20 mg·L-1氯胺酮的水體中暴露30 min）。在棲底性及鏡像反射試驗(yàn)中每組魚為10～12條，社會交互試驗(yàn)中每組魚為10～12對。

1.5 行為測試方法

1.5.1 棲底性試驗(yàn) 測試方法參考文獻(xiàn)［6］并略加改進(jìn)，行為測試裝置為1.5 L梯型魚箱（15.2 cm高×7.1 cm寬×27.9 cm頂面長×22.5 cm底面長），行為測試時，魚箱最大程度地裝滿水，光照強(qiáng)度與之前的培養(yǎng)條件相同，每條魚放于測試箱中，其游泳行為用側(cè)面的紅外高清攝像頭（30 Frames／Sec，分辨率640×480）實(shí)時記錄，并將視頻以 AVI格式保存。利用Zebralab 3.3分析軟件，將觀察箱垂直方向分為上下兩個分區(qū)，分析得到運(yùn)動軌跡及各項(xiàng)運(yùn)動指標(biāo)。

1.5.2 鏡像反射試驗(yàn) 行為測試裝置為長方型魚箱（10 cm高×10 cm寬×25 cm長），魚箱的四壁由鏡子制成，將距四壁1 cm的區(qū)域劃定為鏡像區(qū)，魚進(jìn)入該區(qū)域會看到自己的鏡像，同時設(shè)定中央?yún)^(qū)，分別統(tǒng)計(jì)進(jìn)入各區(qū)的次數(shù)、停留時間，此外根據(jù)魚接近鏡像的活動性，判定其對鏡像是否具有攻擊性。

1.5.3 社會交互行為試驗(yàn) 行為測試裝置與棲底性試驗(yàn)中一致，不同的是每個測試箱中放入兩條魚，魚之間的距離，為斑馬魚的社會交互行為最直接的表現(xiàn)方式。設(shè)定閾值來判定兩條魚是否接近，并統(tǒng)計(jì)接近的次數(shù)及持續(xù)時間。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用GraphPad Prism 5軟件繪制曲線與統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用表示。組間比較采用oneway ANOVA進(jìn)行分析，Newman-Keuls test進(jìn)行組間后檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 致幻類化合物對斑馬魚棲底行為的影響 Fig 1顯示不同處理?xiàng)l件下斑馬魚在觀察箱中6 min內(nèi)的垂直方向的運(yùn)動軌跡，紅色軌跡線提示高活動性，綠色表示正常運(yùn)動。正常情況下斑馬魚進(jìn)入新環(huán)境后，會有短暫棲底，之后多數(shù)會沿測試箱邊界表現(xiàn)明顯的探索興趣，從運(yùn)動軌跡上可見正常組斑馬魚上下穿梭較頻繁，魚在箱壁附近活動較多。甲基苯丙胺處理組中，使魚的運(yùn)動集中于底部，且在測試過程中長時間靜止不動。氯胺酮短時暴露使魚的穿梭活動明顯減少。

Fig 1 Com puterized video tracks of zebrafish behavior in the tank in first 6 m in after exposed to different experimental challengesA：Normal；B：METH 2 mg·L-1；C：Ketamine 20 mg·L-1

藥物處理斑馬魚后的行為指標(biāo)變化與運(yùn)動軌跡圖一致。如Fig 2所示，與正常組相比，6 min內(nèi)甲基苯丙胺預(yù)處理組的運(yùn)動路程無明顯變化，在上部的停留時間減少92%，垂直穿越次數(shù)下降76%（P＜0.01），氯胺酮處理組與正常組相比，運(yùn)動路程無變化，垂直穿越次數(shù)下降76%（P＜0.01），而與甲基苯丙胺處理不同的是，其上部停留時間與正常組相比雖有下降趨勢，但差異無顯著性。

2.2 致幻類化合物對斑馬魚鏡像反射行為的影響 從Fig 3可見，正常的斑馬魚表現(xiàn)出對鏡像非常明顯的興趣，在觀察的時間內(nèi)基本停留在鏡像區(qū)，而給用METH后，斑馬魚的軌跡發(fā)生明顯變化，運(yùn)動軌跡向中央?yún)^(qū)域集中，氯胺酮處理后的斑馬魚，其軌跡呈現(xiàn)出往復(fù)繞圈的刻板現(xiàn)象。

統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，與正常組相比，甲基苯丙胺與氯胺酮急性暴露30 min后，斑馬魚在中央?yún)^(qū)的停留時間比例有了明顯提高（P＜0.01），相應(yīng)的，在鏡像區(qū)停留時間比例分別下降35%及40%（P＜0.05），此外，甲基苯丙胺處理后，斑馬魚整體的高活動性比例上升（P＜0.05），而氯胺酮處理組，斑馬魚整體的高活動性比例與正常組相比無變化，但在鏡像區(qū)其高活動性運(yùn)動比例提高280%，表明該化合物短時暴露可使斑馬魚對鏡像產(chǎn)生一定的攻擊性（Fig 4）。

2.3 致幻類化合物對斑馬魚社會交互行為的影響 斑馬魚的天性為群集性，正常斑馬魚每兩條魚一組放入測試箱中后，根據(jù)魚之間的接近程度，設(shè)定3 cm為兩魚接近的閾值，在這一標(biāo)準(zhǔn)下，正常魚表現(xiàn)明顯的彼此接近。

Fig 2 Behavioral effects of zebrafish over 6m inZebrafish models are exposed to differentexperimental challenges for 30min in a pre-treatment beaker before being transferred into the tank for behavioral observatio**P＜0.01 vs the normal group.

給予不同藥物預(yù)處理后，分別統(tǒng)計(jì)接近時間與接近次數(shù)，結(jié)果如Fig 5所示，與正常組相比，甲基苯丙胺急性處理后，斑馬魚之間接近次數(shù)無變化，但魚之間的接近時間明顯降低（P＜0.05），而氯胺酮則使斑馬魚之間接近次數(shù)與接近時間均有明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），提示這兩種化合物可以影響斑馬魚的群集性，抑制魚的社會交互行為，但作用機(jī)制不同。

3 討論

本文所選用的建模化合物氯胺酮和甲基苯丙胺均屬于新型毒品的范疇，其濫用近些年呈現(xiàn)快速的增長。盡管兩者均可使人產(chǎn)生幻覺，但其作用機(jī)制不同。氯胺酮屬于NMDA受體拮抗劑，是臨床常用的一種麻醉藥，氯胺酮產(chǎn)生濫用的基礎(chǔ)為“分離性幻覺”，致幻作用是導(dǎo)致濫用的基本因素。其作用機(jī)制主要抑制丘腦，可選擇性阻斷痛覺沖動的傳導(dǎo)，同時又能興奮腦干及邊緣系統(tǒng)，產(chǎn)生意識模糊、短時記憶缺失、痛覺完全消失，產(chǎn)生意識和感覺分離狀態(tài)。而甲基苯丙胺屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮劑，主要是促進(jìn)多巴胺神經(jīng)末梢多巴胺的釋放并抑制其再攝取，并與多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體相結(jié)合，抑制多巴胺的再攝取，而使細(xì)胞間隙多巴胺濃度升高，表現(xiàn)為欣快感、幻覺并提高警覺性［7］。

在非人類的動物模型模擬幻覺、語言混亂與思維紊亂等外在癥狀難以實(shí)現(xiàn)，因此，為了建立具有代表性的致幻作用評價(jià)動物模型，必須表現(xiàn)更特異性地與致幻性相聯(lián)系的其他特征。致幻劑引發(fā)的癥狀很多與精神障礙相類似，目前公認(rèn)的其典型的臨床表現(xiàn)，包括夢幻覺、錯覺、易激惹行為及交流障礙等，實(shí)驗(yàn)所采用的棲底、鏡像及社會交互3個行為模式來建立其篩選模型，即是基于力求模擬致幻劑的上述臨床表現(xiàn)來設(shè)計(jì)的。

斑馬魚作為精神神經(jīng)藥理研究的建模動物，在給予不同刺激條件下，其復(fù)雜的行為模式與精神神經(jīng)障礙行為均能良好體現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，在梯形測試箱中，斑馬魚垂直方向的運(yùn)動軌跡可用于棲底行為的評測，以運(yùn)動距離、不同區(qū)域停留時間、上下穿越次數(shù)等參數(shù)，作為模型的評價(jià)指標(biāo)，可用于焦慮與恐懼、藥物依賴與戒斷等精神行為反應(yīng)的測試［4-5］。

鏡像測試是研究致幻性非常關(guān)鍵及特征性模型，正常的魚接近鏡子會看到自已的鏡像，即為同類，它會表現(xiàn)出對同類的親近，因此一直停留在鏡子的附近（即鏡像區(qū)），而致幻性化合物會使魚對自己的鏡像產(chǎn)生錯覺，認(rèn)為是敵人或哺食者，進(jìn)而會產(chǎn)生攻擊與逃避，在軌跡上表現(xiàn)出在中央?yún)^(qū)的停留明顯增加［8-9］。此外斑馬魚屬于群集性動物，正常情況下同種生物會成群游動與追逐［10-11］，根據(jù)這一特性而建立的社會交互測試作為評測交流障礙的一個手段，一旦魚的彼此接近時間及次數(shù)發(fā)生變化，表明其先天的群集性受到影響。

本實(shí)驗(yàn)中所用甲基苯丙胺的濃度選擇參考之前在斑馬魚行為測試中的預(yù)試結(jié)果，其標(biāo)準(zhǔn)是使動物產(chǎn)生明顯行為變化，但不引起死亡。氯胺酮急性暴露的濃度是根據(jù)預(yù)試結(jié)果確定的亞麻醉濃度。實(shí)驗(yàn)中兩種化合物急性處理組在3個模型中均表現(xiàn)出與正常組的明顯差異，與正常組相比，其在棲底試驗(yàn)中表現(xiàn)為上下穿越次數(shù)明顯降低，表明其探索興趣受到抑制；在鏡像反射測試中在鏡像區(qū)停留時間明顯減少，高活動性比例明顯上升，提示對鏡像的偏愛消失，并對鏡像產(chǎn)生了一定的攻擊性；而社會交互試驗(yàn)中，藥物處理后兩條魚之間的接近時間明顯下降，提示魚先天的群集性發(fā)生改變。

Fig 3 Computerized video tracks of zebrafish behavior in them irror box in first 6 m in after exposed to different experimental challenges A：Normal；B：METH 2 mg·L-1；C：Ketamine 20 mg·L-1.

Fig 4 Behavioral responses tom irror image of zebrafish over 6m in after pre-exposed to different experimental challenges for 30m in*P＜0．05，**P＜0．01 vs the normal group.

Fig 5 Effects of pre-treatment w ith drugs on social behaviors of zebrafish*P＜0．05，**P＜0．01 vs the normal group.

上述結(jié)果表明，不同致幻類化合物均使斑馬魚的3種行為模式發(fā)生特征性的變化，這些變化可以作為化合物致幻性行為的考察指標(biāo)。而由于甲基苯丙胺與氯胺酮的作用機(jī)制不同，因此在模型中也體現(xiàn)出化合物作用的個性變化，在我們在隨后的測試中發(fā)現(xiàn)，氯胺酮在棲底測試中其最明顯的特征是刻板轉(zhuǎn)圈及上下穿越次數(shù)明顯下降，而對于棲底性則體現(xiàn)出了隨著濃度升高魚在上部運(yùn)動趨勢愈加明顯的特征；而甲基苯丙胺則體現(xiàn)出隨著濃度升高棲底明顯增加的趨勢。社會交互測試中，氯胺酮處理組除了使魚之間的接近時間明顯下降，更使得兩條魚接觸次數(shù)明顯減少，魚之間幾乎不存在任何互動。所有這些行為指標(biāo)的差異更加證實(shí)斑馬魚行為模型的特異性與可靠性，也與在嚙齒類模型上的一些行為測試結(jié)果相互驗(yàn)證［12-13］。

綜上所述，通過考察斑馬魚棲底性、鏡像反射及社會交互3個行為表現(xiàn)，我們可以對致幻性化合物對于運(yùn)動活動性、認(rèn)知功能、情感意識等方面的影響進(jìn)行快速評價(jià)，與大小鼠模型相比，斑馬魚對神經(jīng)系統(tǒng)類藥物反應(yīng)的靈敏度較高，而多個指標(biāo)對于斑馬魚的復(fù)雜行為模式進(jìn)行評價(jià)可提供更多的信息，能較全面地反映藥物對動物行為的影響，另外，由于斑馬魚給藥方式簡單，需藥量少，模型建立成本低等優(yōu)點(diǎn)，相信其行為模型會在神經(jīng)精神藥理學(xué)研究具有廣泛的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Mathur P，Guo S.Use of zebrafish as amodel to understand mechanisms of addiction and complex neurobehavioral phenotypes［J］.Neurobiol Dis，2010，40：66-72.

［2］ Stewart A，Wu N，Cachat J，et al，Pharmacologicalmodulation of anxiety-like phenotypes in adult zebrafish behavioral models［J］.Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry，2011，35：1421-31.

［3］ Cachat J，Canavello P，Elegante M，et al.Modeling withdrawal syndrome in zebrafish［J］.Behav Brain Res，2010，208：371-6.

［4］ 顏 慧，宮澤輝.斑馬魚谷氨酸功能低下精神分裂行為模型的建立［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2011，27：134-7.

［4］ Yan H，Gong ZH.A behavioralmodel of hypoglutamatergic schizophrenia in the zebrafish［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27：134-7.

［5］ 顏 慧，宮澤輝.利用斑馬魚建立成癮性藥物對運(yùn)動機(jī)能及認(rèn)知功能影響的評價(jià)模型［J］.中國藥理學(xué)通報(bào)，2012，28：1173-7.

［5］ Yan H，Gong Z H.Zebrafish as a model system for assessing effects of addictive drugs on locomotor activity and cognitive performance［J］.Chin Pharmacol Bull，2012，28：1173-7.

［6］ Bencan Z，Sledge D，Levin ED.Buspirone，chlordiazepoxide and diazepam effects in a zebrafish model of anxiety［J］.Pharmacol Biochem Behav，2009，94：75-80.

［7］ Zhang Y，Xu Z，Zhang S，et al.Profiles of psychiatric symptoms among amphetamine type stimulant and ketamine using inpatients in Wuhan，China［J］.JPsychiatr Res，2014，53：99-102.

［8］ Cachat J，Kyzar E J，Collins C，et al.Unique and potent effects of acute ibogaine on zebrafish：The developing utilityofnovel aquatic models for hallucinogenic drug research［J］.Behav Brain Res，2013，236：258-69.

［9］ Kyzar E J，Collins C，Gaikwad S，et al.Effects of hallucinogenic agentsmescaline and phencyclidine on zebrafish behavior and physiology［J］.Prog Neuro-Psychoph，2012，37：194-202.

［10］Oliveira R F，Silva JF，Simoes JM.Fighting zebrafish：characterization of aggressive behavior and winner-loser effects［J］.Zebrafish，2011，8：73-81.

［11］Miller N，GerlaiR.From schooling to shoaling：patterns of collectivemotion in zebrafish（Danio rerio）［J］.PLoS One，2012，7（11）：e48865.

［12］Singh R，Kosten T，Kinsey B，et al.Dose-dependent changes in the locomotor responsesmethamphetamine in BALB／c mice：Low doses induce hypolocomotion［J］.Pharmacol Biochem Behav，2012，103：230-6.

［13］Ezequiel U，JoséL，Richard W，et al.Memantine reverses social withdrawal induced by ketamine in rats［J］.Exp Neurobiol，2013，22：18-22.