重組組蛋白去乙酰化酶2-p EGFP-C2質粒的構建及表達

章 慧，黃 成，卞爾保，趙 斌，吳寶明，劉昌偉，陳小霞，李 俊

（安徽醫科大學1.藥學院、2.肝病研究所，安徽 合肥 230032）

組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）為組蛋白去乙酰化酶家族中重要的I型成員之一，能夠激活組蛋白的氨基端，使組蛋白發生去乙酰化，從而導致相關腫瘤抑制因子的缺失或表達降低［1-2］。HDAC2參與多種腫瘤如肝癌、胃癌、卵巢癌及前列腺癌等等的發生發展過程，同時對炎癥的生成也起到一定的促進作用［3-4］。其廣泛表達于多種癌細胞和炎癥細胞中，但HDAC2在體外相關細胞的過表達作用及蛋白的表達定位有待進一步研究。本研究利用pEGFP-C2載體帶有熒光蛋白序列為報告基因的特點，將HDAC2基因克隆入pEGFP-C2載體，構建能夠融合表達綠色熒光蛋白與HDAC2蛋白的重組質粒，并在非洲綠猴腎成纖維細胞COS-7中分析HDAC2基因的表達及分布部位，為進一步研究HDAC2蛋白的生物學功能提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 Tag1感受態細胞由安徽醫科大學生命科學院饋贈。真核表達重組質粒 pEGFP-C2和COS-7細胞為安徽省天然藥物活性研究重點實驗室保存。胰蛋白酶高糖DMEM液體培養基（Hyclone公司，美國）；Xho I、BamH I內切酶（Fermentas生物工程公司，加拿大）；T4 DNA Ligase（Fermentas公司，加拿大）；Lipofectamine 2000、Opti-MEM、TRIzol Reagent（Invitrogen公司，美國）；膠回收試劑盒（AxyGen公司，美國）、質粒提取試劑盒（TIANGEN公司，中國）；逆轉錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；LA Taq酶（TaKaRa公司，日本）；LB-Kana瓊脂培養基為本實驗室配置；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；顯微數碼攝影機（Nikon公司，日本）。HDAC2、β-actin和GFP抗體購于Anbo公司和博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因HDAC2 DNA片段的擴增制備根據目的基因序列、引物設計原則設計PCR特異性引物，引物序列上游引物：5′-CAGCTCGAGTATGGCGTACAGTCAAG-3′；下游引物：5′-ATAGGATCCTCAGGGGTTGCTGAGCTGT-3′，上、下游引物分別引入酶切位點Xho I、BamH I及保護性堿基，并保持HDAC2閱讀框正確；所有引物由上海生工生物技術有限公司合成，擴增長度為1 467 bp。PCR擴增HDAC2 cDNA條件：以逆轉錄所得HepG2 cDNA為模板，采用 PCR擴增 HDAC2全長 PCR體系（25 μl），其中上、下游引物（10μmol·L-1）各 1μl、cDNA 1μl、dNTPMix 4μl、10×LA buffer 2.5μl、TaKa-Ra LA Taq 0.5μl和無酶水15μl。反應條件為94℃，預變性 5 min；94℃變性 1 min；59℃退火 40 s；72℃延伸1 min 45 s；循環35次后72℃延伸5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴增產物，按照試劑盒說明回收DNA并純化。

1.2.2 重組真核表達載體pEGFP-C2-HDAC2的構建 “1.2.1”步驟中回收得到的HDAC2擴增產物和pEGFP-C2質粒分別用Xho I、BamH I內切酶進行雙酶切，凝膠電泳分離，回收HDAC2基因和質粒，用T4 DNA連接酶連接，在16℃條件下連接反應進行12 h。連接產物轉化Tag 1感受態細菌，轉化的菌液涂布于LB-Kana瓊脂培養基上，37℃正置20 min，然后繼續倒置過夜。挑取單克隆菌落接種到LB-Kana液體培養基，37℃、210 r·min-1搖菌過夜。采用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切方法篩選、鑒定陽性重組質粒，并由上海生工生物技術有限公司作進一步的測序鑒定。

1.2.3 pEGFP-C2-HDAC2重組質粒轉染COS-7細胞 COS-7細胞在含10%胎牛血清的高糖NMEM培養基中培養，轉染前取對數生長期的COS-7細胞，取2 ml于6孔板中，置37℃、5%CO2培養24 h后細胞融合生長至90%～95%，分別將3μg質粒和3μl脂質體溶于150μl OPTI-MEM培養基中，5 min后將兩者混合室溫靜置20 min；用PBS洗滌細胞3次，加入質粒-脂質體混合物，置37℃、5%CO2培養6 h后，更換10%胎牛血清DMEM培養液繼續培養24 h。實驗同時設置未轉染組、空質粒轉染組作為對照。

1.2.4 RT-PCR檢測細胞中HDAC2的基因表達

實驗分為3組：未轉染組、空質粒對照組、HDAC2質粒組。處于對數期生長的COS-7細胞消化后接種于細胞瓶中，每瓶細胞數為5×105個，轉染后6 h后轉為全培養基培養，并繼續培養24 h，收集細胞。按TRIzol試劑盒操作說明提取細胞總RNA，凝膠電泳判斷有無降解。按TaKaRa試劑盒操作程序，取2 μl總RNA，2μl Primer Mix，6μl Water反轉錄成cDNA。設計PCR擴增HDAC2的引物序列，上游引物：5′-ATAAAGCCACTGCCGAAGAA-3′，下游引物：5′-TCCTCCAGCCCAATTAACAG-3′，擴 增 長 度 245 bp；β-actin的引物序列，上游引物：5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′，擴增長度205 bp。取 1μl進行PCR反應。取 PCR反應產物5μl，加6×Loading Buffer 1μl，經1.5% 瓊脂糖凝膠（含 EB 0.5 mg·L-1）電泳30 min（80 V），圖像分析儀采集圖像，以內參β-actin為基準分析，即以擴增目的片段的灰度比值表示所擴增目的基因片段的相對表達水平，重復實驗3次。

1.2.5 Western blot檢測融合蛋白及HDAC2蛋白的表達 實驗分組、處理同上，轉染48 h后PBS洗3次，每組加1 ml裂解液（含10μl PMSF），冰上裂解30 min。4℃離心30 min，取上清加入上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。每孔上樣20μl總蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳結束后用BioRAD濕轉儀器將蛋白轉到PVDF膜上，電流200 mA，時間分別為 40、60、60 min，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉3 h，膜清洗后一抗封閉，一抗濃度為：β-actin（1∶500）、HDAC2（1∶500），GFP（1∶800），4℃過夜。膜清洗 4次，每次 10 min，再加入與一抗匹配的二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，膜清洗4次，每次10 min，重復實驗3次。

1.2.6 熒光制片 細胞爬片的制備：用多聚甲醛潤洗蓋玻片，置超凈臺風干，加適量培養液。然后用胰酶消化細胞，適量密度重新種入放置了蓋玻片的培養皿中，37℃、5%CO2培養過夜，待轉染。即轉染24 h后棄培養基。用預冷的PBS溶液洗3遍。DAPI孵育5～10 min，棄DAPI溶液，PBS溶液洗3次，最后用濾紙盡可能去除蓋玻片上的溶液，用熒光封片膠將蓋玻片封于載玻片上。

2 結果

2.1 目的基因HDAC2的擴增及重組載體p EGFP-C2-HDAC2鑒定 HDAC2引物中引入酶切位點和保護性堿基，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分離，與 DNA Marker比對片段大小符合，pEGFPC2-HDAC2重組質粒經Xho I和 Bam H I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，符合預期大小的條帶，表明HDAC2已被插入到pEGFP-C2載體中，見Fig 1。基因序列分析測序結果進一步證實HDAC2基因正確插入pEGFP-C2載體，HDAC2序列與GenBank上完全一致。

Fig 1 The expression of mRNA was detected by semi-quantitative RT-PCRA：Expression of HDAC2 in COS-7 cells；B：Identification of the recombinant plasmid pEGFP-C2-HDAC2 by XhoI and BamHI digestion（1，4：DNA marker；Lane2：The amplied fragment of HDAC2；Lane3：recombinant plasmid digested with XhoI and BamHI）

2.2 pEGFP-C2-HDAC2在COS-7細胞中的表達在轉染24 h后觀察即可見綠色熒光細胞，pEGFPC2在細胞中呈現彌散性分布表達，見Fig 2，熒光制片中可看到，pEGFP-C2載體中的綠色熒光彌散于整個細胞，而pEGFP-C2-HDAC2質粒的熒光只在細胞核中呈現，表明HDAC2在細胞核表達。見Fig 3。

Fig 2 Expression of EGFP in COS-7 cells at 24h after transfection with plasmid pEGFP-C2-HDAC2detected by fluorescence staining；1：Bright field；2：Dark field；A：Normal COS-7 cells，B：pEGFP-C2 transfected COS-7 cells；C：pEGFP-C2-HDAC2 transfected COS-7 cells.

Fig 3 Expression of EGFP in COS-7 cells at 24h after transfection with plasmid pEGFP-C2-HDAC2detected by fluorescence staining；A：pEGFP-C2 transfection；A1：DAPI；A2：The localization of pEGFP-C2；A3：Composite diagram B：pEGFP-C2-HDAC2；B1：DAPI；B2：The localization of pEGFP-C2-HDAC2；B3：Composite diagram

2.3 pEGFP-C2-HDAC2質粒轉染進COS-7細胞中HDAC2的表達檢測 經RT-PCR和Western blot結果顯示：連接質粒轉染組的細胞中可見HDAC2的表達，而空質粒組和未轉染組的細胞中HDAC2的表達較低，見Fig 4A和B。同時Western blot顯示空質粒組和連接質粒組分別在27 ku和85 ku處有表達，表明pEGFP-C2與HDAC2發生了融合，更進一步說明pEGFP-C2-HDAC2的構建成功。見Fig 4C。

3 討論

HDACs為組蛋白去乙酰化酶，其主要的功能是從N-乙酰賴氨酸中刪除乙酰基團，發生去乙酰化，抑制基因的轉錄［5］。組蛋白去乙酰化酶根據結構分為3類：Ⅰ類包括 HDAC1-3和 HDAC8；Ⅱ類包括：HDAC4-7和 HDAC9-11；Ⅲ類包括：SIRT 1-7［6］。HDAC2是Yang等［7］在1996年從人的HeLa細胞的cDNA文庫中篩選得到的。HDAC2高表達于子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及胃癌等多種腫瘤的器官和組織中［8-9］。HDAC2 siRNA對 HepG2細胞的增殖具有抑制作用，轉染24 h后，細胞生長逐漸減慢［10］。COS-7細胞是研究蛋白質結構與功能的有力工具，多種載體可以在COS-7細胞中表達外源基因。本研究采用成功構建的真核表達載體pEGFP-C2-HDAC2轉染宿主細胞COS-7對HDAC2基因的真核表達進行了初步研究。

PEGFP-C2就是一種可編碼增強型綠色熒光蛋白（EGFP）的真核質粒載體，其上攜帶有EGFP表達報告基因，EGFP則是GFP的一個突變體，其熒光強度及光漂白抗性明顯增強，是迄今為止最佳的活體分子標志物之一［11-12］。本研究通過基因重組技術，將包含起始密碼子和終止密碼子的HDAC2 cDNA插入pEGFP-C2載體EGFP的上游5′端，并保持相同的閱讀框，成功構建HDAC2和綠色蛋白融合基因的真核表達載體，經雙酶切鑒定證實目的片段插入到載體相應的位置，載體經基因測序證實基因構建成功，序列和GenBank上完全符合。本研究將HDAC2基因成功構建至pEGFP-C2載體并轉染至COS-7細胞，通過PCR和Western blot檢測，與未轉染組和空質粒組比較，連接質粒組有HDAC2高表達。熒光顯微鏡觀察，空質粒組熒光呈彌散型，同時通過免疫熒光制片觀察到HDAC2在COS-7細胞中定位于細胞核，且熒光清晰可見。使用GFP抗體檢測融合蛋白的表達，結果顯示空質粒組和連接質粒組分別在不同位置有表達。進一步說明質粒的構建成功，也為進一步研究HDAC2在體內細胞發生表達作用奠定基礎。

Fig 4 The expression of mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blotA：The mRNA expression levels of HDAC2 in COS-7 cells（M：Marker；Lane1： Control； Lane2： pEGFP-C2； Lane3： pEGFP-C2-HDAC2）；B：The protein expression levels of HDAC2 in COS-7 cells（Lane1：Control；Lane2：pEGFP-C2；Lane3：pEGFP-C2-HDAC2）；C：The protein expression levels of GFP in COS-7 cells.（Lane1：Control；Lane2：pEGFP-C2；Lane3：pEGFP-C2-HDAC2）

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