槲皮素對結直腸癌細胞SW480增殖與Bcl-2、C-myc表達的影響Δ

羅輝燕，馮冬冬，于偉娜，丁陳波，李靜，馮繼紅#（.重慶市第三人民醫院腫瘤科，重慶 40004；.壽縣中醫院心內科，安徽 壽縣 00；.遵義醫學院附屬醫院腫瘤醫院，貴州 遵義 5600）

結直腸癌（Colorectal carcinoma，CRC）是常見消化系統惡性腫瘤之一。全球范圍內，CRC分別位居男、女性惡性腫瘤的第三、四位，導致每年61萬人死亡[1-2]。在中國，近年CRC發病率逐年上升，且發病年齡提前，每年約有40萬新增病例，目前在我國消化系統惡性腫瘤中列第二位[3]。

槲皮素是黃酮類化合物重要的一員，據研究發現，槲皮素及其衍生物可抑制多種腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，具有較為廣闊的應用前景。槲皮素具有明確的抗腫瘤作用，對乳腺癌、前列腺癌、結腸癌和肺癌等都具有預防作用和一定的治療作用[4]。槲皮素抗腫瘤作用涉及多種機制，但對結直腸癌的作用機制尚不清楚。本研究旨在通過觀察槲皮素對結直腸癌SW480細胞增殖的抑制作用及對其B細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、癌基因C-myc表達的影響，探討其抗腫瘤作用機制，為槲皮素在結直腸癌化療中的應用提供理論依據。

1 材料

1.1 儀器

CKX31型顯微鏡（日本Olympus公司）；CJ-2 F型超凈工作臺（蘇州馮氏實驗動物設備有限公司）；MCO175型CO2培養箱（日本Sanyo公司）；Spectra Mr型全波長酶標儀（美國Dynex公司）；聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀、垂直電泳槽、凝膠成像分析儀（美國Bio-Rad公司）

1.2 試劑

L-15培養基（Leibovitz’s L-15 Medium，美國Gibco公司）；胎牛血清（FBS，美國Hyclone公司）；兔抗人Bcl-2單抗、兔抗人C-myc單抗（美國Epitomics公司）；兔抗人β-actin單抗（北京中衫金橋公司）；槲皮素（純度≥98.5%）、MTT、二甲亞楓（DMSO）購自美國Sigma公司；Trizol、實時熒光定量反相（qRT）PCR（qRT-PCR）試劑盒、Premix Taq酶、Marker均購自大連寶生物工程有限公司；凱基全蛋白提取試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜、瓊脂糖（Agarose）、TAE（50×）均購自上海碧云天生物技術有限公司；ECL發光試劑盒（美國Millipore公司）。

1.3 細胞

人結直腸癌細胞株SW480購自中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 細胞培養

SW480細胞培養于含10%FBS的L-15培養基中，在5%的CO2飽和濕度、37Ⅸ恒溫培養箱中常規培養。SW480細胞呈單層貼壁生長，每2～3 d用0.25%胰酶消化，以1∶2傳代。SW480細胞生長狀態穩定，呈對數生長期時用于試驗。

2.2 藥物處理與分組

槲皮素用DMSO制備成貯備液，－20Ⅸ貯藏，備用。試驗時用L-15培養基稀釋，DMSO的最終質量分數＜0.1%。試驗分3大組，即空白對照（200μl L-15培養液）組、溶劑對照（200μl L-15培養液+150μl DMSO）組、試驗（200μl L-15培養基+不同梯度濃度的槲皮素，槲皮素的終濃度分別為5、10、20、40、80、160 μmol/L）組。

2.3 MTT法檢測

取對數生長期的SW480細胞懸液，以每孔3×103個細胞接種于96孔培養板，每孔加含10%FBS的L-15培養液200μl，于37Ⅸ、5%CO2培養箱培養8 h，在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁后按“2.2”項下方法給藥。繼續培養24、48、72h，每一濃度設5個復孔，于各時間段前4h每孔避光加入MTT（5g/L，PBS稀釋）20μl，培養終止后棄上清加入DMSO 150μl/孔，振蕩溶解10min，待結晶完全溶解后于酶標儀570nm波長處檢測各個濃度的光密度（OD），計算細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率（IR）＝[1－（試驗組OD－溶劑對照組OD）/（空白對照組OD－溶劑對照組OD）]×100%。

2.4 qRT-PCR檢測SW480細胞中Bcl-2、C-myc mRNA的表達

Bcl-2引物序列 ，上 游 :5′-TGTGGCCTTCTTTGAGTTCG-3′，下游:5′-ATCCCAGCCTCCGTTATCC-3′，擴增片段長度為137bp；C-myc引物序列，上游:5′-CGAGGAGGAGAACTTCTACCAGC-3′，下 游:5′-CGAGAAGCCGCTCCACATACAGTCC-3′，擴增片段長度為471bp；β-actin引物序列，上游:5′-ACAGAGCCTCGCCTTTGCCGATC-3′，下游:5′-TGGGTCATCTTCTCGCGGTTGG-3′，擴增片段長度為 417 bp。分別培養細胞24、48、72h后，收集細胞，Trizol法提取RNA，鑒定完RNA純度和完整性后，反轉錄制備cDNA；PCR反應條件為:95Ⅸ預變性lmin；95Ⅸ變性15 s，58Ⅸ退火20 s，72Ⅸ延伸20 s，循環40次；72Ⅸ延伸5min終止反應。qRTPCR反應結束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴增曲線結果的可靠性并設定循環閾值（Ct），以Bcl-2/β-actin、C-myc/β-actin比值分別代表各自相對表達水平，計算Bcl-2、C-myc mRNA的相對表達強度。各組設3個復孔，試驗重復3次。

2.5 Western blot法檢測SW480細胞中Bcl-2、C-myc蛋白的表達

分組收集用藥物干預SW480細胞48 h后的細胞，加入適量細胞裂解液，冰浴30min，高速離心后取上清采用BCA法測定蛋白濃度，調整到標準濃度后分別取50μl樣品進行SDS-PAGE電泳，半干轉膜法轉至PVDF膜。5%的脫脂奶粉封閉1 h，分別加一抗稀釋液（兔抗人單抗）4Ⅸ孵育過夜，再用辣根酶標記山羊抗兔IgG二抗37Ⅸ孵育1 h。PBST緩沖液洗膜10min×3次。ECL熒光顯色后在暗室中進行X片曝光，結果用凝膠成像系統分析拍照并對凝膠條帶的信號強度進行半定量分析，以Bcl-2/β-actin、C-myc/β-actin的比值作為各自蛋白的相對表達強度。試驗重復3次。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 槲皮素對SW480細胞增殖的抑制作用

不同濃度的槲皮素對SW480細胞增殖有明顯抑制作用。由于OD可間接反映活細胞的數目，槲皮素濃度范圍為20～160 μmol/L時，隨著槲皮素濃度的增加，SW480細胞在各個時間點的OD均降低，說明抑制率呈上升趨勢，顯示抑制作用呈劑量依賴關系。槲皮素在作用不同時間時對SW480細胞增殖抑制有不同作用，當槲皮素濃度＜20 μmol/L時，與溶劑對照組比較，作用24、48、72h后的抑制率均無明顯變化（P＞0.05），但都起到一定抑制作用；當槲皮素濃度在20～160 μmol/L時，隨著時間的延長，對SW480細胞增殖的抑制明顯增強（P＜0.05），顯示抑制作用呈時間依賴關系。槲皮素對SW480細胞增殖的抑制作用見圖1。

圖1 槲皮素對SW480細胞增殖的抑制作用Fig 1 Inhibition of quercetin on the proliferation SW480 cells

3.2 槲皮素（40μmol/L）作用SW480細胞不同時間對Bcl-2、C-myc mRNA表達的影響

槲皮素（40 μmol/L）作用SW480細胞0、24、48、72h后，與溶劑對照組比較，試驗組SW480細胞Bcl-2、C-myc mRNA表達強度隨槲皮素作用時間的延長而減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）。Bcl-2、C-myc mRNA的表達見圖2。

3.3 槲皮素（40μmol/L）作用SW480細胞不同時間對Bcl-2、C-myc蛋白表達的影響

圖2 Bcl-2、C-myc mRNA的表達Fig 2 mRNAexpression of Bcl-2and C-myc

槲皮素（40μmol/L）作用SW480細胞48、72h后，與溶劑對照組比較，試驗組Bcl-2、C-myc蛋白表達強度隨槲皮素作用時間的延長而減弱，差異有統計學意義（P＜0.05）。Bcl-2、C-myc蛋白的表達見圖3。

圖3 Bcl-2、C-myc蛋白的表達Fig 3 Protein expression of Bcl-2and C-myc

4 討論

CRC是我國常見的惡性腫瘤，其發病率和病死率在我國呈逐年上升趨勢。肝轉移是導致結直腸癌患者死亡的主要原因，盡管國內外有關CRC轉移已有很多研究，但仍無解決臨床實際問題的成果[4]。目前CRC的治療以綜合治療為主，多采用中藥聯合化療、放療和手術。中藥及其有效成分的對CRC作用的研究越來越深入，部分已應用到臨床，并取得了一定的效果[5-6]。

已有多項研究表明，槲皮素對多種惡性腫瘤如胃癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、結腸癌、卵巢癌、膽囊癌等均有抑制其生長的作用，并可促進惡性腫瘤細胞的凋亡[7]。槲皮素可通過多途徑來發揮抗腫瘤效果、抑制多種腫瘤細胞的分裂增殖，通過多種途徑促進其凋亡，抑制腫瘤細胞遷移及侵襲，降低其耐藥性，在臨床抗腫瘤治療中，發揮著重要作用[8]。近年研究結果表明，槲皮素可抑制SW480、結腸癌細胞HCT116、結腸腺癌細胞Caco-2等CRC細胞的增殖，誘導其凋亡[9-11]。本研究結果表明，不同濃度的槲皮素對SW480細胞的生長和增殖有明顯抑制作用，并呈劑量-效應關系。由此可見，槲皮素在體外對結直腸癌細胞的增殖具有明顯抑制作用，且能夠誘導腫瘤細胞凋亡。

為闡明槲皮素誘導的細胞凋亡機制，筆者進一步研究了SW480細胞中Bcl-2和C-myc mRNA和蛋白表達的變化，且二者的表達隨作用時間延長而減弱。已知Bcl-2是抗凋亡基因，可穩定細胞內質膜系統、抑制線粒體內離子及細胞色素C的釋放，從而抑制凋亡的發生；能抑制許多抗腫瘤藥物誘導細胞凋亡，降低其細胞毒性；還可與其他癌基因如C-myc和抗癌基因p53相互作用，間接地調控細胞程序性死亡[12]。C-myc癌基因具有促進細胞增殖和誘導細胞凋亡的雙重作用。槲皮素是否通過抗凋亡基因Bcl-2作用于C-myc導致其表達變化尚不得而知，其關聯調節作用尚需證實。綜上所述，一定濃度的槲皮素在體外能誘導SW480細胞中Bcl-2和C-myc的表達下調，說明槲皮素可能通過Bcl-2和c-myc基因對細胞增殖起抑制作用并誘導其凋亡，具體作用機制有待于進一步研究。

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