婦血康顆粒的促排卵作用Δ

付書婕，李迪，黃增瓊，巫玲玲，蔣偉哲（廣西醫科大學藥學院，南寧 530021）

婦血康顆粒是根據民間臨床經驗，采用廣西地區獨有的天然名貴草藥滇桂艾納香（Blumea riparia（Bl.）DC.）作為主藥，經現代科學工藝濃縮精煉而成的純中藥制劑，是一種療效確切，安全無毒副作用的婦科、產科血癥止血藥。臨床研究表明，婦血康顆粒對流產后子宮出血不凈（血瘀證）療效確切。其中，君藥滇桂艾納香具有補血活血、祛瘀生新、斂血止血之功效，能促進子宮平滑肌收縮，使血管閉合，加快子宮內膜脫落，具有很好的止血作用[1]。中藥復方治療月經失調、功能性不孕等下丘腦-垂體-卵巢（HPO）軸功能失調性疾病由來已久，而對其藥效學研究始于20世紀80年代[2]。目前，有關婦血康顆粒的促排卵作用研究尚未見報道，本課題組首次采用未成年大鼠自然條件下HPO軸功能不健全模型，觀察婦血康顆粒對大鼠排卵的影響，并探討其相關機制，為充分利用廣西特色藥材資源提供實驗依據。

1 材料

1.1 儀器

FMA-87型全自動放免γ計數器（上海技術監督局實驗工廠）；SZX10型顯微鏡（日本Olympus公司）；BS110 S型電子天平（德國Sartorius公司）；HP8453型分光光度計（美國Agilent公司）；Fj-200型高速分散均質機（上海標本模型廠）。

1.2 藥品與試劑

婦血康干膏粉（廣西桂西制藥有限公司，批號:110510，0.7 g干膏粉相當于10 g婦血康顆粒）；己烯雌酚（合肥久聯制藥有限公司，批號:20110102，規格:0.5mg/片）；ERα（MC-20）兔抗大鼠多克隆抗體（一抗，批號:SC-542）、兔二步法檢測試劑盒（二抗，批號:SC-658）均購自美圖Santa Cruz公司；DAB顯色試劑盒（批號:110820）、孕激素（P）放射免疫試劑盒（批號:110912）、雌二醇（E2）放射免疫試劑盒（批號:111015）、黃體生成素（LH）放射免疫試劑盒（批號:111020）、促卵泡激素（FSH）放射免疫試劑盒（批號:110723）均購自北方生物技術研究所。

1.3 動物

SPF級Wistar未成年大鼠40只，♀，6～7周齡，體質量95～110 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心[實驗動物使用許可證號:SCXK（桂）2009-0002]。

2 方法

2.1 分組、給藥與標本取材

40只大鼠隨機均分為4組，即正常對照（等容生理鹽水）組、己烯雌酚（1mg/kg）組與婦血康高、低劑量（400、100mg/kg）組。ig給藥，每天1次，連續14 d。于末次給藥1 h后，拔眼球采血3ml，置于未加抗凝的試管中，靜置20min，以離心半徑為8 cm、3000 r/min離心20min，取血清，－80Ⅸ貯藏，備用。

2.2 性激素指標測定

通過放射免疫分析法常規測定大鼠血清FSH、LH、E2和P的水平，按照相應試劑盒的方法步驟分別測定。

2.3 卵泡成熟總數計算與卵巢、子宮的組織形態觀察

處死大鼠，剖取卵巢、子宮，分別稱定質量后固定于10%甲醛內，常規脫水，包埋，6 μm切片，蘇木精-伊紅（HE）染色，光鏡觀察卵巢、子宮的組織形態變化。卵泡成熟總數以每只大鼠雙側卵巢切片中黃體數與成熟卵泡數相加之和計。通過顯微鏡觀察大鼠卵巢、子宮的組織形態學。

2.4 統計學方法

3 結果

3.1 婦血康顆粒對大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響

與正常對照組比較，婦血康高劑量組大鼠血清LH活性增強，E2、P含量減少，差異有統計學意義（P＜0.05）；婦血康低劑量組大鼠血清LH活性增強，FSH活性減弱，P含量減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。婦血康顆粒對大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響見表1。

表1 婦血康顆粒對大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響（，n＝10）Tab 1 Comparison of the leves of FSH，LH，E2and P in serum of model rats among those groups（，n＝10）

表1 婦血康顆粒對大鼠血清FSH、LH、E2和P水平的影響（，n＝10）Tab 1 Comparison of the leves of FSH，LH，E2and P in serum of model rats among those groups（，n＝10）

與正常對照組比較:＊P＜0.05vs.normal control group:＊P＜0.05

組別正常對照組己烯雌酚組婦血康低劑量組婦血康高劑量組P，n g/ml 27.00±8.9519.25±7.95＊15.33±10.50＊11.56±9.70＊劑量，mg/k g 1100400 FSH，mu/ml 0.76±0.340.60±0.330.46±0.24＊0.77±0.33 LH，mu/ml 0.38±0.470.83±0.81＊1.31±0.58＊2.15±0.82＊E2，p g/ml 1284±3221275±3291062±263987±371＊

3.2 婦血康顆粒對大鼠成熟卵泡總數的影響

與正常對照組比較，婦血康高、低劑量組大鼠成熟卵泡總數增加，差異有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。婦血康顆粒對大鼠成熟卵泡總數的影響見表2。

3.3 婦血康顆粒對大鼠卵巢組織形態學的影響

大體觀察到己烯雌酚組大鼠卵巢略大，顏色較深；婦血康高、低劑量組與正常對照組無明顯差異。鏡下觀察到正常對照組可見較多原始、初級、次級卵泡，成熟卵泡較少見，偶見黃體；婦血康高、低劑量組可見各級卵泡，成熟卵泡略增，黃體增多，顆粒細胞層變厚；己烯雌酚組可見各級卵泡，較多的成熟卵泡，黃體增多，卵細胞清晰可見，顆粒細胞層明顯增厚。大鼠卵巢組織形態學變化見圖1、圖2。

表2 婦血康顆粒對大鼠成熟卵泡總數的影響（，n＝10）Tab 2 Comparison of the amount of mature follicle of rats among those groups（，n＝10）

表2 婦血康顆粒對大鼠成熟卵泡總數的影響（，n＝10）Tab 2 Comparison of the amount of mature follicle of rats among those groups（，n＝10）

與正常對照組比較:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01vs.normal control group:＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

劑量，mg/k g組別正常對照組己烯雌酚組婦血康低劑量組婦血康高劑量組1100400卵泡成熟總數/個5.12±1.649.37±2.87＊＊7.50±1.31＊8.25±2.76＊＊

圖1 大鼠卵巢組織形態學變化（HE，100×）A.正常對照組；B.婦血康低劑量組；C.婦血康高劑量組；D.己烯雌酚組Fig 1 Morphology change of ovarian tissue of rats among those groups（HE，100×）A.normal control group；B.Fuxuekang low-dose group；C.Fuxuekang high-dose group；D.diethylstilbestrol group

3.4 婦血康對大鼠子宮組織形態學的影響

大體觀察到己烯雌酚組大鼠子宮輕度充血，明顯增粗、子宮長度沒有明顯變化；婦血康高、低劑量組與正常對照組無明顯差異，大鼠子宮外觀色白，直徑較細。鏡下觀察到正常對照組大鼠子宮管壁較薄，黏膜較薄，固有層結締組織較致密，腺體較少，腺腔小，上皮細胞呈柱狀，排列緊密；婦血康高、低劑量組大鼠子宮內腺體數目略增多，略大，其他不太明顯；己烯雌酚組大鼠子宮內膜增厚明顯，組織疏松，子宮腺體增多、變大，上皮細胞高柱狀排列，間質內有水腫。大鼠子宮組織形態學變化見圖3。

4 討論

圖2 大鼠卵巢組織形態學變化（HE，200×）A.正常對照組；B.婦血康低劑量組；C.婦血康高劑量組；D.己烯雌酚組Fig 2 Morphology change of ovarian tissue of rats among those groups（HE，200×）A.normal control group；B.Fuxuekang low-dose group；C.Fuxuekang high-dose group；D.diethylstilbestrol group

圖3 大鼠子宮組織形態學變化（HE，400×）A.正常對照組；B.婦血康低劑量組；C.婦血康高劑量組；D.己烯雌酚組Fig 3 Morphology change of uterus of rats among those groups（HE，400×）A.normal control group；B.Fuxuekang low-dose group；C.Fuxuekang high-dose group；D.diethylstilbestrol group

在卵泡發育過程中，卵泡細胞表達的功能性促性腺激素受體是卵泡獲得對促性腺激素發生反應能力的前提[3]。由于卵泡發育成熟及成熟卵泡排出是連續過程，正常排卵需要完整的HPO軸之間的正常功能，其中任何一個環節失調，或器質性病變，都可造成暫時或長期的卵泡發育障礙、無排卵[4]。卵泡能否發育成熟直接關系到婦女生殖及內分泌功能是否正常。在下丘腦促性腺激素釋放激素的作用下，垂體分泌的FSH和LH直接參與卵巢功能的調節[5]。FSH主要促進卵泡的各種細胞的生長發育，以利生殖細胞的成熟，并刺激卵巢顆粒細胞的增生，使卵泡激素分泌及芳香化酶活化[6]。LH主要作用是促排卵，在卵巢周期中期出現高峰，促使卵泡成熟，排出卵子，使排卵后的卵泡變成黃體，黃體的形成與維持都需要有LH，并能使黃體合成分泌P。FSH是刺激卵泡發育最重要的激素，可促使竇前卵泡及竇狀卵泡的顆粒細胞增殖與分化，縫隙連接形成、分泌卵泡液，使卵泡生長發育[7]。FSH和LH在卵巢功能調節中具有協同作用[3]。

本研究結果表明，高、低劑量婦血康顆粒均能明顯增強未成年♀大鼠血清LH活性及增加卵泡成熟總數。婦血康低劑量組可減弱FSH的活性，但顯微鏡下觀察仍表現為促進卵巢的成熟，增加卵泡成熟總數，可能婦血顆粒康本身就有類似FSH的作用；婦血康高劑量組大鼠血清FSH分泌量無明顯變化（本研究中接近正常值），提示婦血康顆粒在一定劑量范圍內對FSH活性有減弱作用，具體機制有待進一步探討。

婦血康顆粒能促進卵巢的成熟和排卵，促進黃體的形成與合成，使單一雌激素作用轉為雌、孕激素的共同作用。顯微鏡下觀察可見婦血康對正常未成年大鼠的子宮組織未有明顯影響，但稍有促進子宮向分泌期轉化的趨勢。婦血康顆粒可降低健康大鼠E2、P的含量，其抑制作用不是通過FSH及LH而引起的。因此可以推測婦血康顆粒抑制E2及P的作用機制是婦血康顆粒與雌激素受體結合，直接或間接抑制芳香化酶或孕激素合成的關鍵酶。

婦女進入更年期，卵巢功能逐漸減退，分泌的雌激素水平降低，對下丘腦、垂體的負反饋作用減弱，使下丘腦促性腺激素釋放激素分泌增加，繼而FSH分泌增加，升高的FSH會加快卵泡成熟的速度，促使雌激素的分泌又增加，因而雌激素水平呈現或高或低的波動狀態[8]。在此變化過程中。人體不斷地進行自身調節，使HPO軸達到一種新的相對平衡狀態。E2下降的過程并非呈線性，而是波動性下降，直至最終穩定在較低水平，這種雌激素的撤退比雌激素低下本身更為重要[9]。婦女更年期這種HPO軸功能的失調，不僅影響了其有關激素的效應器官功能，而且直接或間接地影響了植物神經系統，引起全身一系列復雜的病理改變，導致更年期綜合征的發生[10]。

筆者選擇未成年大鼠作為HPO軸及靶器官結構功能調節模型，是因為其HPO軸調節功能不健全，沒有正常卵巢周期。而未成年大鼠是自然條件下HPO軸功能不健全的模型，未成年大鼠HPO軸及靶器官反應靈敏，便于觀察效果；未成年大鼠來源充足，周齡、體質量等生理狀況容易控制在同一水平，可減少實驗的系統誤差。

本研究發現，婦血康顆粒能夠使大鼠血清E2含量減少，下丘腦弓狀核雌激素受體升高，使局部下丘腦神經肽Y水平降低，促性腺激素釋放激素分泌升高，從而使FSH活性減弱，LH活性增強，促進排卵。綜上所述，婦血康顆粒能通過多環節、多靶點發揮促排卵作用，其調節HPO軸功能的作用是婦血康顆粒的重要藥理作用之一，為臨床防治生殖內分泌平衡失調性疾病提供了藥理學基礎。本研究對藥效學深入研究，為拓展企業優勢產品婦血康顆粒的新用途——促進卵泡成熟及排卵作用提示了一個研究方向。但是，婦血康顆粒促進排卵的作用機制可能是多方面的，有待進一步系統、細致的研究。

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