紫色疣石磺化學成分的分離與鑒定Δ

孫變娜，沈和定，吳洪喜，姚理想，程知慶（.上海海洋大學省部共建水產種質資源發掘與利用教育部重點實驗室，上海 20306；2.浙江省海洋水產養殖研究所，浙江 溫州 325005；3.浙江省近岸水域生物資源開發與保護重點實驗室，浙江 溫州 325005）

紫色疣石磺（Peronia verruculata）隸屬軟體動物門（Mollusca）腹足綱（Gastropoda）肺螺亞綱（有肺類，Pulmonata）縮眼目（Systellommatophora）石磺科（Onchidiidae），柔軟無貝殼，軀體背后部有樹枝狀鰓，有自由生活幼蟲期，被認為是一種進化的貝類[1]。紫色疣石磺多見于我國福建、廣東、海南、香港等地沿海潮間帶的中下部灘涂，越南、泰國等東南亞國家沿海也有分布，范圍較廣，資源豐富。

由于石磺科早期系統分類工作滯后，研究材料屬種不明晰現象嚴重[2]，阻礙了國內、外學者對石磺次生代謝產物研究的步伐，至今對石磺類海洋動物的化學成分研究甚少。為尋找石磺類動物的活性成分和有藥用前景的海洋天然產物，科學開發我國海洋生物資源，筆者對采自我國湛江的紫色疣石磺進行了化學成分研究，從中分得5個化合物，分別鑒定為2，2′-氧代雙（1，4-二叔丁苯）（1）、膽甾醇（2）、α-棕櫚精（3）、尿嘧啶（4）、胸腺嘧啶（5）。其中，化合物1為首次以天然產物形式分離；所有化合物均為首次從紫色疣石磺中分離得到。

1 材料

1.1 儀器

SGW X-4型顯微熔點測定儀（溫度計未校正，上海精密科學儀器有限公司）；AvanceⅡ600型核磁共振光譜（NMR）儀（德國Bruker公司）；6538 UHD and Accurate-Mass Q-TOF LC/MS、1100 LC/MSD Trap型離子阱液質聯用儀（美國Agilent公司）；薄層硅膠板（青島海洋化工有限公司）；RV10型旋轉蒸發儀（德國IKA公司）；AUY120型電子分析天平（廣州湘儀機電設備有限公司）。

1.2 試劑

Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia公司）；層析用硅膠（200～300目，青島海洋化工有限公司）；甲醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、氯仿等化學試劑均為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；氘代氯仿（美國劍橋同位素實驗室）；水為蒸餾水。

1.3 藥材

石磺材料于2012年11月采自廣東湛江，經上海海洋大學沈和定教授鑒定為紫色疣石磺P.verruculata，憑證標本保存在上海海洋大學海洋貝類實驗室（No.12 DZ-1）。

2 提取與分離

將新鮮紫色疣石磺解剖、去內臟，濕質量約3kg，剪碎，用甲醇（5 L）于室溫下浸提3次，每次7 d。合并提取液，減壓回收溶劑（至無醇味），將浸膏分散于500ml蒸餾水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇各萃取3次，減壓回收溶劑，分別得石油醚萃取物15.5g、乙酸乙酯萃取物27.2g、正丁醇萃取物18.9 g。將石油醚和乙酸乙酯萃取物分別進行硅膠（200～300目）柱色譜分離，石油醚-乙酸乙酯（100∶0→0∶100，V/V）洗脫系統梯度洗脫，得到A～F 6個組分。其中，B組分以石油醚-乙酸乙酯（90∶10，V/V）洗脫，經反復硅膠柱層析，得到化合物1（19.2mg）；石油醚-乙酸乙酯（80∶20，V/V）和石油醚-乙酸乙酯（75∶25，V/V）洗脫段經乙酸乙酯重結晶，分別得化合物2（12.7mg）和3（12.7mg）。D組分經Sephadex LH-20柱色譜分離，以氯仿-甲醇（1∶1，V/V）洗脫，經反相硅膠柱層析，再以甲醇-水（2∶1，V/V）洗脫，得到化合物4（7.4mg）和5（10.3mg）。

3 結構鑒定

化合物 1:淡黃色油狀物；HR-ESI-MS（m/z）:394.3296[M+H]+（計算值為394.3236）；UV λmax（MeOH）:294nm。化合物1的1H-NMR和13C-NMR數據見表1。由表1可知，氫譜高場區為2個積分為9的信號，低場區為3個積分為1的信號；碳譜共有10個信號。結合分子質量推斷，該化合物應為對稱結構。該化合物共有28個碳、42個氫。根據分子質量可知，該化合物除了碳和氫之外，還有一個氧原子。因此，該化合物分子式應為C28H42O。從氫譜高場區的2個積分為9的信號δ1.29和1.33推斷，該分子應有兩種化學環境不同的叔丁基，碳譜δ31.4、30.2、34.9、34.5也證明了這一點。氫譜低場區的3個氫的耦合常數明顯符合1，2，4三取代苯的特點。碳譜芳香區有6個信號，也支持這個推斷。通過HMBC和NOESY可以推斷出，2個叔丁基分別處于苯環的1位和4位；2位碳的化學位移較大，應該是和氧相連的碳；氧原子處于該分子的對稱中心。因此，本化合物被鑒定為2，2’-氧代雙（1，4-二叔丁苯）。本結構此前已被合成獲得[3]，而本研究中為首次以天然產物形式分離得到。化合物1的結構式見圖1。

化合物2:白色片狀晶體，mp:144～146Ⅱ。ESI-MS（m/z）:387[M+1]+。1H-NMR（600MHz，CDCl3）δ:5.30（1 H，d，J＝4.3 Hz，H-6），3.48（1 H，m，H-3），1.01（3 H，s，H-19），0.91（3 H，d，J＝6.6Hz，H-21），0.87（3 H，d，J＝6.7Hz，H-26），0.86（3 H，d，J＝6.7Hz，H-27），0.64（3 H，s，H-18）；13C-NMR（150MHz，CDCl3）δ:140.9（C-5），121.8（C-6），71.8（C-3），56.9（C-14），56.3（C-17），50.2（C-9），42.4（C-4，13），39.9（C-12），39.7（C-24），37.4（C-1），36.6（C-10），36.3（C-22），36.0（C-20），32.0（C-7），32.0（C-8），31.7（C-2），28.4（C-16），28.2（C-25），24.5（C-15），24.0（C-23），23.0（C-27），22.8（C-26），21.2（C-11），19.6（C-19），18.9（C-21），12.0（C-18）。以上數據與文獻[4-5]報道一致，故鑒定其為膽甾醇。

表1 化合物1的1H-NMR和13C-NMR（CDCl3，600/150MHz）數據Tab 1 1H-NMR and13C-NMR（CDCl3，600/150MHz）data of compound 1

圖1 化合物1的結構式Fig 1 Chemical structure of compound 1

化合物3:白色片狀結晶，mp:70～72Ⅱ。ESI-MS（m/z）:331[M+H]+。1H-NMR（600MHz，CDCl3）δ:4.20（1 H，dd，J＝11.5，4.5Hz，H-1′a），4.15（1 H，dd，J＝11.5，6.5Hz，H-1′b），3.93（1 H，m，H-2′），3.69（1 H，dd，J＝11.5，4.0Hz，H-3′b），3.60（1 H，dd，J＝11.5，5.5Hz，H-3 a），2.35（2 H，t，J＝7.5Hz，H-2），1.62（2 H，m，H-3），1.26～1.30（24h，m），0.88（3 H，t，J＝7.0Hz，H-16）；13C-NMR（150MHz，CDCl3）δ:70.3（C-1′），65.2（C-2′），63.3（C-3′），174.4（C-1），34.2（C-2），31.9（C-3），29.7～29.3（C-4～13），24.9（C-14），22.7（C-15），14.1（C-16）。以上數據與文獻[6]報道一致，故鑒定其為α-棕櫚精。

化合物4:淡黃色針狀結晶，mp:308～311Ⅱ。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）δ:10.95（1 H，s，N-H），10.81（1 H，s，N-H），7.51（1 H，t，J＝7.6Hz，H-6），5.49（1 H，d，J＝7.6Hz，H-5）；13C-NMR（150MHz，DMSO-d6）δ:164.5（C-1），151.6（C-2），142.9（C-6），102.1（C-5）。以上數據與文獻[7]報道基本一致，故鑒定其為尿嘧啶。

化合物5:淡黃色針狀結晶，mp:333～335Ⅱ。ESI-MS（m/z）:125（M-H）－。1H-NMR（600MHz，DMSO-d6）δ:10.98（1 H，s，N-H），10.51（1 H，s，N-H），7.27（1 H，s，H-6），1.72（3 H，s，5-CH3）；13C-NMR（150 MHz，DMSO-d6）δ:164.9（C-4），151.4（C-2），137.7（C-6），107.6（C-5），11.9（5-CH3）。以上數據與文獻[8]報道一致，故鑒定其為胸腺嘧啶。

4 討論

石磺產品已在江蘇鹽城（俗稱海癩子）、浙江溫州（俗稱涂龜）、福建寧德（俗稱土鮑）等地形成廣泛的市場。民間流傳石磺有治哮喘、治風濕病、滋補、助消化、消除疲勞、明目的功效；冰糖燉石磺據說對治療哮喘有特效，并常被作為產后婦女良好的滋補品。沿海居民食用石磺的歷史悠久[2]。在《中國海洋藥物辭典》中有如下記載:石磺別名土海參，四季捕撈，捕后洗凈，除去內臟，取肉鮮用；肉入藥，有滋補強壯之功效，主治肝硬化、久病體虛等癥狀[9]。近幾年國內石磺產品供不應求，已從越南等國大量進口。目前國內、外對石磺的研究主要集中在系統分類[1，10-12]、生物學特性[13-15]、受精機制[16]、繁殖[17-19]、胚胎發育[20-21]、神經系統[22]、營養價值[23]、國內外石磺活性物質研究現狀[2]等方面。其中，Marianna C等[24]從中國石磺Onchidium sp.中分離獲得一種吡喃酮聚丙酸酯，Wang JR等[25]再次從中分得3個聚丙酸酯類化合物，實為我國石磺二次代謝產物研究的先例。

本研究通過對紫色疣石磺甲醇提取物的石油醚、乙酸乙酯部位進行化學成分的分離純化，分離并鑒定出5個化學成分，其中化合物1為首次以天然產物形式分離，所有化合物均為首次從紫色疣石磺中分離得到。本研究結果可為石磺這一特色海洋中藥資源的綜合利用與開發提供理論依據。

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