芪歸糖痛寧顆粒的UPLC指紋圖譜研究Δ

吳健，高家榮，韓燕全，李穎（1.安徽中醫藥大學藥學院，合肥 3003；.安徽中醫藥大學第一附屬醫院，合肥 30031）

芪歸糖痛寧顆粒為安徽中醫藥大學第一附屬醫院國家中醫臨床研究基地（糖尿病）特色醫院制劑，處方由黃芪、當歸、生地黃、葛根、延胡索、雞血藤、威靈仙等七味中藥組成，具有益氣活血、化瘀通痹之功效，臨床用于治療糖尿病周圍神經病變[1-2]。中藥復方制劑成分復雜，其質量隨原藥材產地、來源、種植方法、采收季節、炮制及貯藏條件等不同而差異很大[3-5]。中藥的整體作用特點決定了它不同于西藥，中藥的質量控制方法須對起效的全成分進行控制[6-7]。中藥色譜指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒別手段，是當前符合中藥特色的評價中藥真實性、穩定性和一致性的質量控制的主要模式之一[8]。為系統、完整地反映芪歸糖痛寧顆粒的內在質量，本研究采用超高效液相色譜（UPLC）法建立了其指紋圖譜，以達到控制制劑質量、保證用藥安全有效的目的。

1 材料

1.1 儀器

Acquity H-Class型UPLC儀，包括四元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 2工作站（美國Waters公司）；KQ3200 DB型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；BP211 D型電子天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

芪歸糖痛寧顆粒（安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑中心，批號:20110711、20110924、20111129、20120106、20120301、20120430、20120611、20120824、20121016、20130109）；葛根素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:110752-200511）；乙腈、甲醇（色譜純，美國Tedia公司）；微孔濾膜（0.22 μm，上海陸納生物科技有限公司）；水為蒸餾水，磷酸等其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱:Acquity BEH C18（100mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫:26Ⅱ；流動相:乙腈-0.05%磷酸水溶液，梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速:0.25ml/min；檢測波長:254nm；進樣量:1.0μl。

表1 梯度洗脫程序Tab 1 Gradient elution condition

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取葛根素對照品2.80mg，置于5ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

分別取10批次芪歸糖痛寧顆粒各適量，研細，取0.5 g置于10ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，超聲處理（功率:100 W，頻率:40 kHz）20min，放冷，再用甲醇定容，搖勻，取上清液，濾過，即為供試品溶液。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取批號為20110711的供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6次，記錄色譜圖。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD為0.03%～0.53%，相對峰面積的RSD為0.10%～1.17%，表明本方法精密度良好，符合指紋圖譜技術要求。

2.4.2 穩定性試驗 取批號為20110711的供試品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、16、24h進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD為0.07%～0.88%，相對峰面積的RSD為0.08%～2.74%，表明供試品溶液在24h內穩定。

2.4.3 重復性試驗 取批號為20110711的芪歸糖痛寧顆粒適量，按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖。結果表明，各共有峰相對保留時間的RSD為0.02%～0.35%，相對峰面積的RSD為0.23%～2.71%，表明本方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的構建與評價

2.5.1 指紋圖譜的獲得 取10批芪歸糖痛寧顆粒各適量，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。10批芪歸糖痛寧顆粒的UPLC指紋圖譜見圖1。

圖110 批芪歸糖痛寧顆粒的UPLC指紋圖譜Fig 1 UPLC fingerprint of 10batches of Qiguitang tongning granules

2.5.2 參照峰的選擇 在保留時間為8.60min附近的色譜峰峰面積最大、出峰時間適中且穩定，經與對照品對照認定為葛根素的吸收峰，因此選擇其為參照物。色譜見圖2。

2.5.3 相似度評價 將10批樣品的色譜峰導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004 A版）中進行數據處理，各色譜峰進行自動匹配后共獲得13個共有峰；以最大共有峰（9號峰）為參照峰（S），將各色譜峰保留時間和峰面積與同一圖譜中參照物的保留時間和峰面積進行比較，其比值為各色譜峰的相對保留時間和相對峰面積，詳見表2、表3。以色譜峰的平均值建立對照指紋圖譜[9]，利用相關系數法計算指紋圖譜的相似度，均＞0.99，結果見表4。

圖2 超高效液相色譜圖S1.葛根素對照品；S2.芪歸糖痛寧顆粒Fig 2 UPLC chromatogramsS1.puerarin control；S2.Qiguitang tongning granules

表2 不同批次芪歸糖痛寧顆粒的相對保留時間Tab 2 The relative retention time of different batches of Qiguitang tongning granules

表3 不同批次芪歸糖痛寧顆粒的相對峰面積Tab 3 The relative peak area of different batches of Qiguitang tongning granules

表4 10批樣品的相似度評價結果Tab 4 Results of similarity evaluation of 10batches of sample

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本研究比較了加熱回流與超聲兩種樣品提取方法，結果發現兩者沒有明顯差異，但超聲提取法操作更簡單、快捷且溶劑損耗少，故選取超聲提取法作為本研究的提取方法。本研究也比較了不同提取溶劑的提取效果，分別采用70%甲醇、80%甲醇、甲醇作為提取溶劑，結果發現經甲醇提取后的溶液雜質較少且澄清，色譜圖峰形好、基線平穩，故選取甲醇為提取溶劑。

3.2 色譜條件的選擇

在色譜柱選擇的過程中，筆者比較了Acquity BEH C18（100mm×2.1mm，1.7 μm）、Acquity BEH C18（50mm×2.1mm，1.7 μm）和Acquity HSS T3（50mm×2.1mm，1.8 μm）3種色譜柱及柱溫、流速等條件，經優化得到本研究的色譜條件。

在選擇檢測波長時，筆者分別對黃芪甲苷、梓醇、阿魏酸、葛根素、延胡索乙素和齊墩果酸對照品的檢測波長進行綜合驗證比較，由于黃芪甲苷在紫外區（200～400nm波長處）無吸收；梓醇和延胡索乙素雖在紫外區有吸收，但在此波段下存在的吸收峰較少；齊墩果酸在紫外區存在末端吸收；阿魏酸分離效果不理想；而葛根素在紫外區不僅有吸收，而且通過對樣品進行全波長掃描，發現其在254nm波長處存在的吸收峰最多、檢測的圖譜信息量較多、峰形較好，且各色譜峰的分離度較好、基線較平穩，故選擇254nm作為檢測波長。

在流動相的選擇中，筆者分別考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.05%磷酸水溶液和乙腈-0.5%甲酸水溶液4個流動相系統的梯度洗脫條件，最終發現以乙腈-0.05%磷酸水溶液作為流動相系統時各峰的分離度較好，且基線平穩，有利于特征峰的分析，故選其作為流動相。

本研究在色譜條件的優化過程中，確定了在25min內能把供試品溶液的各種物質洗脫完畢；然后不斷地改變流動相（乙腈-0.05%磷酸水溶液）比例以調節其極性的大小，達到使溶液中的物質被一一洗脫分離的目的，并且在該檢測波長下，基線較平穩、峰形與分離度較好，最終確定了本研究的梯度洗脫條件。

3.3 小結

本研究建立了芪歸糖痛寧顆粒的UPLC指紋圖譜，經方法學考察，精密度、穩定性和重復性試驗結果相對保留時間和相對峰面積的RSD＜3%，符合指紋圖譜技術要求。并且，對10批芪歸糖痛寧顆粒樣品進行的相似度評價結果顯示，其相似度均在0.99以上，也符合指紋圖譜技術要求。綜上，所建指紋圖譜可用于芪歸糖痛寧顆粒的質量控制。

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