衍生基團對環糊精空腔疏水性的影響

王亞敏 ， 王金鵬 ， 金征宇 ， 徐學明

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江南大學，江蘇 無錫，214122；3.食品安全與營養協同創新中心，江南大學，江蘇 無錫 214122）

環糊精（Cyclodextrin，CD）是由 D-吡喃型葡萄糖單元通過α-（1→4）-糖苷鍵連接而成的一類環狀低聚麥芽糖，因吡喃葡萄糖環C-3，C-5氫原子位于空腔內并覆蓋了配糖氧原子，使環糊精空腔內部形成疏水性空腔[1]，能與脂溶性分子形成包合物，已經廣泛用于食品、醫藥、化工、材料和分析化學等領域[2-5]。環糊精與客體分子形成包合物，受一些關鍵因素影響，如環糊精空腔大小與客體分子幾何尺寸匹配程度、疏水作用力、氫鍵、高能水的釋放等[6]；對于空腔大小幾乎相同的環糊精及其衍生物來講，環糊精空腔與客體分子的匹配程度差別可以忽略，然而衍生基團造成了環糊精衍生物和環糊精母體截然不同的包埋效果。例如，Hirayama等[7]研究了前列腺素E2在各種環境下的脫氫速率，發現其與甲基-β-CD包埋后對反應起抑制作用，而母體β-CD則對前列腺素E2脫氫反應起加速作用；Pitha等[8]報道雌二醇與HP-β-CD形成的包合物壓片，該片經舌下給藥后導致藥物的有效吸收，而β-CD則不會改善雌二醇的吸收。此外，同一環糊精母體的不同衍生物之間的包埋效果也大不相同，Arima等[9]報道Tracrolimus（一種防止器官移植排異藥）與磺丁基醚-β-CD作用時基本上以1∶1的比例包合，而與HP-β-CD作用時就可能形成包合比為1∶2甚至1∶3、1∶4的包合物，且磺丁基醚-β-CD的包合效果優于 HP-β-CD。

雖然上述報道介紹了母體環糊精與衍生物對于客體分子包埋行為之間存在明顯差異，然而并未揭示衍生基團造成包埋效果差異的內在原因，并且不同衍生基團造成環糊精空腔疏水性的差異并無相關報道。作者選擇對環境極性敏感的芘作為熒光探針，研究環糊精衍生基團造成空腔疏水性的變化規律。芘是一種常用的測定介質極性的熒光探針，存在5個電子振動發射譜帶，其中第一發射譜帶I1（約373 nm）是對稱性禁阻的，對所處環境的極性變化比較敏感，在極性環境中，由于電子振動偶合的干擾，其對稱性遭到破壞，使得I1發射譜帶強度增強，而第3條發射譜帶I3（約384 nm）對環境的極性變化不敏感，因此，I1/I3值可以表征芘所處環境的極性強弱[10-11]。Glushko等[12]均選用芘作為探針對溶液極性進行測定。根據芘的這一原理，采用環糊精對芘進行包埋，以芘的熒光I1/I3值指示環糊精疏水性空腔的變化，以期為揭示環糊精衍生物的衍生基團對環糊精母體空腔疏水性變化規律提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑

芘標準樣品：純度＞99%，美國Aldrich公司產品；β-環糊精（β-CD）、羥丙基-β-環糊精（HP-β-CD）、甲基-β-環糊精（M-β-CD）、磺丁基醚-β-環糊精（S-β-CD）：分析純，山東新大生物技術有限公司產品；甲醇、乙醇、乙二醇、氯仿、二甲亞砜、環己烷：分析純，國藥集團產品。

1.2 儀器

熒光光譜儀：F-7000，HITACHI產品；氮吹儀：QSC-12T，上海泉島公司產品；恒溫攪拌器：C-MAG HS7，IKA產品；超聲波清洗儀KQ5200：昆山市超聲儀器有限公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 芘儲備液的配制 準確稱取10.112 mg芘至燒杯，加入適量甲醇將其溶解后轉移到50 mL潔凈的容量瓶中，并用甲醇稀釋至容量瓶刻度，可得到1×10-3mol/L的芘的儲備液。

1.3.2 探針靈敏性檢測 準確移取50 μL芘的儲備液于潔凈的10 mL容量瓶中，將其置于氮吹儀通N2至接近瓶底吹干甲醇，再分別加入甲醇、乙醇、氯仿、乙二醇、二甲亞砜、環己烷等不同極性的有機溶劑，作為溶液極性變化指示劑，定容至刻度，超聲30 min，置于熒光光譜儀進行熒光掃描。熒光掃描條件如下：激發波長 334 nm，激發狹縫設置10 nm，發射狹縫 5 nm，掃描范圍：360～460 nm，掃描速率為1 200 nm/min，PMT檢測電壓為400 V。以第一發射譜帶的熒光強度為I1，第三發射譜帶的熒光強度為I3分別計算掃描圖譜的I1/I3值，則該比值越大，表明極性越強、疏水性越弱。

1.3.3 母體環糊精-芘包合物的配制 準確移取50 μL芘的儲備液于潔凈的10 mL容量瓶中，將其置于氮吹儀通N2至接近瓶底吹干甲醇，再分別加入濃度為 0.016 4 g/mL 的 β-環糊精溶液 2、4、6、8、10 mL，不足10 mL部分用移液管加水定容至刻度，從而保證芘最終濃度為5×10-6mol/L，超聲30min促使環糊精-芘包合物充分形成，25℃下放置48 h，按照1.3.2方法進行測定。

1.3.4 環糊精衍生物-芘包合物的配制 分別配制HP-β-CD、M-β-CD、S-β-CD 與芘包合物溶液，并保持3種衍生物的濃度梯度與母體環糊精一致，按照1.3.3的方法進行測定。

1.3.5 包合常數的確定 依據Benesi-Hildebrand方程確定包合常數和包合比[13]，B-H方程為：

公式（1）中I和I0分別代表體系中有無CD存在時芘的熒光發射強度；[P]0和[CD]0分別代表芘和CD的總濃度；k是儀器常數；Q為芘的熒光量子產率；K代表CD-芘包合物的結合常數。以1/（I-I0）為縱坐標，1/[CD]0為橫坐標繪制雙倒數曲線，直線的截距除以斜率即可求得結合常數K。

2 結果與討論

2.1 探針靈敏度檢測

芘在不同溶液中的熒光光譜圖如圖1所示。

圖1 芘在不同溶劑中的熒光光譜Fig.1 Fluorescence spectra of pyrene in different solvents

由圖1可以看出，芘在不同溶劑中的熒光強度有較大差異，而這幾種溶劑對芘并無熒光淬滅效應[14]，推測這可能是因為芘在不同極性溶液中的溶解度有較大差異所導致的。對圖中的I1/I3值進行計算，結果如圖2所示。

圖2 芘在不同溶劑中的I1/I3值Fig.2 I1/I3value of pyrene in different solvents

由圖2可以看出，芘作為探針測定出溶劑的極性強弱順序分別為：二甲亞砜＞水＞乙二醇＞甲醇＞乙醇＞氯仿＞環己烷，這表明芘對于疏水性強弱具有良好的指示靈敏性，能夠準確指示溶劑環境的疏水性變化。

2.2 環糊精及其衍生物的芘包合物疏水性變化

HP-β-CD、S-β-CD、M-β-CD 等因衍生基團的引入均打破了母體環糊精空腔內的氫鍵[15]，從而大大增加了其在水中的溶解度，可以配成濃度較高的溶液從而包合更多的客體分子。與母體環糊精相比，環糊精衍生物可以更好的增加其溶解性，具有更廣泛的應用價值，然而鮮有報道關注環糊精衍生物與母體環糊精包埋行為存在的差異。以空腔疏水性變化為切入點，分別研究了不同衍生物的引入導致環糊精空腔疏水性的變化，結果如圖3所示。

圖3 環糊精不同濃度下I1/I3值Fig.3 I1/I3values for the various concentrations of CDs

由圖3可以看出，在較低濃度時（0.005 mol/L），β-環糊精空腔疏水性與HP-β-CD及S-β-CD無顯著差異，略高于M-β-CD，這可能是由于，低濃度的環糊精母體在包合物形成過程中所受的主要驅動力為高能水的釋放[16]，空腔疏水性所主導的疏水作用力不占優勢。但隨著環糊精濃度的提高，環糊精空腔疏水性維持穩定，此時，母體環糊精的空腔疏水性遠遠大于各種環糊精衍生物，這可能是由于衍生基團的加入，使母體環糊精原本貢獻空腔疏水性的C、H等質子的疏水性特征減弱，進而影響空腔疏水微環境。劉育等[17]也曾報道化學修飾環糊精的取代基影響環糊精空腔原有的疏水微環境。

由圖3還可以看出，環糊精衍生物的衍生基團造成環糊精母體空腔疏水性大小依次為M-β-CD＜HP-β-CD≈S-β-CD＜β-CD， 推測可能是由于這些衍生基團多數發生在環糊精的C-2位，驅動臨近的位置疏水性C-3發生偏移，從而造成環內疏水性貢獻減弱，衍生基團疏水性越強，則造成環內疏水性減弱越明顯，具體的機理有待進一步探索。

2.3 環糊精及其衍生物的包埋常數

依據1.3.5所述方程的物理意義繪制雙倒數曲線如圖4所示。

圖4 包合常數線性擬合曲線Fig.4 Linear fitting curves of Association constant

由圖4可以看出，曲線均呈良好的線性關系，根據Shalini等[18]的報道，這表明芘-CDs衍生物均形成1∶1的主客體包合物，而芘與β-CD形成1∶2的主客體包合物。

推測在β-CD體系中，芘與β-CD由于疏水相互作用而靠近，芘分子兩端分別插入到β-CD分子的非極性的空腔中，而后兩個β-CD分子在大口端以氫鍵連接與芘形成夾心式的包合物，而β-CD的衍生物在大口端引入取代基，阻礙了其與芘形成類似的1∶2包合物，只能形成1∶1包合物。分別計算4種環糊精與芘的包埋常數，結果見表1。

表1 β-CD及其3種衍生物的包合常數KTable 1 Association constant K of β-CD and its three derivatives

包埋常數是衡量主客體包埋能力的一種參數。由表1可以看出，β-CD對芘的包埋常數遠大于其他3種環糊精衍生物，這說明β-CD與單分子芘形成包合物的能力大于其3種衍生物，而在包合物形成的要素中，環糊精與其衍生物相比最大的區別是衍生基團的引入導致環糊精環內疏水性發生變化，這也進一步證實了疏水性作用力是環糊精及其衍生物與客體分子形成包合物的重要驅動力之一，而且環糊精衍生基團的引入降低了環糊精空腔的疏水性。該發現和Seiki Tanada等[19]的報道并不相符合，在Seiki的研究報道中指出分支環糊精的疏水性比母體環糊精強，然而文中所采用的探針極性靈敏性、探針對于環糊精的匹配性等均無詳細信息，針對環糊精空腔疏水性的研究報道非常少，無法提供詳細參考，但作者的研究將為探索環糊精及其衍生物包埋行為差異提供有價值的參考。

3 結語

極性實驗表明β-CD的空腔疏水性要高于HP-β-CD、M-β-CD、S-β-CD 3 種衍生物， 包埋常數計算結果表明，β-CD比3種衍生物具有更強的包合能力，衍生基團導致環糊精空腔包埋能力下降的機理有待進一步探索。

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