響應(yīng)面法優(yōu)化高剪切分散乳化提取懸鉤子多酚

樊梓鸞 ， 林秀芳 ， 王 麗 ， 王振宇 ，

（1.東北林業(yè)大學 林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱工業(yè)大學 食品學院，黑龍江 哈爾濱150090）

懸鉤子（Rubus kamanowii），俗稱樹莓，是薔薇科（Rosacea）懸鉤子屬（Rubus）的一種落葉漿果類灌木，也是一種新興經(jīng)濟林木品種。樹莓果實為聚合漿果，柔嫩多汁，色澤宜人，風味獨特。除鮮食外，還可生產(chǎn)果醬、果汁、果酒、果凍、軟糖等，為天然保健食品[1]。樹莓果營養(yǎng)豐富，含有比現(xiàn)有栽培水果及其它任何野果都高的維生素E、SOD、氨基丁酸等抗衰老物質(zhì)[2]。特別是鞣化酸、花青素含量豐富，對結(jié)腸、宮頸、乳腺、肝和胰腺癌有一定的預(yù)防作用和療效。在醫(yī)藥、化妝、保健食品等方面有著廣泛的用途[3-4]。

高速剪切技術(shù) （High-speed Shear Dispersing Emulsifier，HSDE）是近幾年新興的提取技術(shù)，是樣品在高剪切分散乳化機上，接受轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)產(chǎn)生的高剪切線速度和高頻機械效應(yīng)帶來的強勁動能，使物料在定、轉(zhuǎn)子狹窄的間隙中受到強烈的機械效應(yīng)、剪切效應(yīng)和氣蝕作用的協(xié)同作用。Hua[5]等運用高速剪切技術(shù)提取黃芪中類黃酮，探討了提取動力學模型，結(jié)果顯示此方法明顯優(yōu)于超聲波提取技術(shù)。孫術(shù)國[6]等運用高速剪切與微波輔助偶聯(lián)技術(shù)提取鮮葛中葛根素，與傳統(tǒng)方法相比具有提取率高、時間短、能耗小等優(yōu)點。

由于多酚類活性物質(zhì)不穩(wěn)定，用傳統(tǒng)方法提取一般提取時間較長，溫度較高，特別是超聲波輔助提取在提取過程中會產(chǎn)生大量自由基，這些自由基會與活性成分中用于清除自由基的集團結(jié)合，從而降低了提取物的抗氧化活性。為了解決以上問題，選取高剪切分散乳化技術(shù)提取懸鉤子多酚，考察提取溶劑濃度、高剪機轉(zhuǎn)速、剪切時間3個工藝參數(shù)，采用響應(yīng)面法進行工藝優(yōu)化，應(yīng)用 Design-Expert軟件進行數(shù)據(jù)擬合[7-8]，探索高剪切分散乳化提取懸鉤子多酚的優(yōu)化工藝條件，以期最大限度的保持懸鉤子有效成分被提取出來，同時不破壞其活性，為懸鉤子多酚產(chǎn)業(yè)化提取提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

懸鉤子 （Rubus kamarowii Nakai.）2012年 8月采摘于伊春，速凍冷藏保存。

1.2 儀器與設(shè)備

SHB循環(huán)水多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；JJ-2型組織粉碎機：常州儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FA25高剪切分散乳化機：上海弗魯克流體機械制造有限公司產(chǎn)品；722可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；721紫外可見分光光度計：上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；DF204電熱鼓風干燥箱：北京西城區(qū)醫(yī)療器械二廠產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 多酚活性成分的提取 取100 g速凍冷藏的懸鉤子漿果，加入200 mL預(yù)冷凍丙酮溶液，先用組織粉碎機勻漿3 min，然后轉(zhuǎn)入高剪切分散乳化機均質(zhì)，最后抽濾，收集濾液，適當稀釋后進行吸光度測定。

1.3.2 多酚多酚質(zhì)量分數(shù)測定 采用福林-酚法[9]，分別取125 μL標準溶液或稀釋樣品，加入125 μL FCR混合靜置6 min，加入質(zhì)量分數(shù)7%Na2CO3（1.25 mL），用水調(diào)至 3 mL（加水 1.5 mL），放置 90 min，760 nm測定吸光度。以標準曲線回歸方程計算總多酚質(zhì)量分數(shù)。

1.3.3 高剪切分散乳化技術(shù)提取懸鉤子多酚的單因素實驗 分別以不同提取溶劑的濃度、高剪切轉(zhuǎn)速、剪切時間為單因素進行單因素實驗，考察各單因素對提取得到多酚含量的影響，每個單因素水平重復(fù)3次測其吸光值。

1.3.4 響應(yīng)面分析法優(yōu)化冷凍均質(zhì)輔助提取多酚的工藝參數(shù) 經(jīng)單因素實驗確定了不同提取溶劑的濃度、高剪切轉(zhuǎn)速、剪切時間為主要影響因素，運用Design-Expert 7.0軟件程序根據(jù)Box-Behnken中心組合實驗設(shè)計原理，采用響應(yīng)面分析法，以多酚質(zhì)量分數(shù)為響應(yīng)值作響應(yīng)面，對提取條件進行優(yōu)化。

2 結(jié)果與討論

2.1 高剪切分散乳化技術(shù)提取懸鉤子多酚的單因素實驗結(jié)果

2.1.1 溶劑濃度對總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響 如圖1可以看出，丙酮體積分數(shù)在50%~80%時，增加趨勢較明顯，在體積分數(shù)為80%時，總多酚質(zhì)量分數(shù)達到696.4 mg/hg鮮果，比體積分數(shù)50%時增加了96.1 mg/hg鮮果，當體積分數(shù)80%以后，隨溶液體積分數(shù)增加，總多酚質(zhì)量分數(shù)降低，這是因為多酚類物質(zhì)的復(fù)雜性，有些物質(zhì)易溶于水 （如黃酮苷類等），而有些物質(zhì)易溶于有機溶劑（如黃酮苷元等），當丙酮體積分數(shù)為80%時，可最大量的溶出有機溶劑溶出物以及水溶物。

圖1 溶劑體積分數(shù)對總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.1 Effect of extraction solvent concentration on polyphenol content

2.1.2 高剪切轉(zhuǎn)速對總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響 如圖2所示，高剪切轉(zhuǎn)速在10 000~16 000 r/min時，總多酚質(zhì)量分數(shù)明顯增加，高剪切轉(zhuǎn)速為16 000 r/min時，總多酚質(zhì)量分數(shù)最高，為693.4 mg/hg鮮果，比10 000 r/min的增加了83.9 mg/hg鮮果，隨著功率增大，總多酚質(zhì)量分數(shù)降低，這是因為功率越大，剪切力越大，破壞了多酚類物質(zhì)（如黃酮母核）的結(jié)構(gòu)，使其質(zhì)量分數(shù)降低。

2.1.3 高剪切時間對總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響 如圖3所示，剪切時間在0~1 min時，增加趨勢較明顯，增加了111.2 mg/hg鮮果，在2~5 min時，變化趨勢平緩，在3 min時，總多酚質(zhì)量分數(shù)最高，達到695.9 mg/hg鮮果。這是因為高轉(zhuǎn)速剪切可以有效的破壞植物細胞壁，使活性物質(zhì)充分溶于溶液中，但隨剪切時間越長，與氧氣接觸時間越多，酚酸可能被氧化成醌，從而多酚質(zhì)量分數(shù)降低。

圖2 剪切轉(zhuǎn)速對總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.2 Effect of HSDE rotary speed on polyphenol content

圖3 剪切時間對總多酚質(zhì)量分數(shù)的影響Fig.3 Effect of treatment time on polyphenol content

2.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化懸鉤子多酚的提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面分析法因素水平的選擇 根據(jù)Box-Behnken的中心組合實驗設(shè)計原理，綜合單因素實驗結(jié)果，選取提取溶液濃度、高剪切轉(zhuǎn)速、和剪切時間3個因素，進行三因素三水平實驗設(shè)計（取中心點為 3），利用 Design-Expert 7.0.0軟件進行數(shù)據(jù)擬合，實驗因素與水平見表 1。

表1 相應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計表Table 1 Factors and levels in the response surface design

2.2.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 以提取溶液濃度（X1）、高剪切轉(zhuǎn)速（X2）、剪切時間（X3）為自變量，總多酚含量（Y）為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析實驗，實驗方案及實驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面分析方案及實驗結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

2.2.3 方差分析結(jié)果 通過Design-Expert 7.0.0軟件進行二次響應(yīng)面回歸分析，對實驗結(jié)果回歸擬合后所得的模擬方程為：Y=687.51+44.29X1+39.43X2+37.96X3-18.24X1X2+12.19X1X3+1.17X2X3-32.36X12-37.84X22-66.09X32。其決定系數(shù) R2=0.978 8，表明該回歸模型的擬合情況較好，實驗值與預(yù)測值比較接近，模型的可靠性可通過方差分析及相關(guān)系數(shù)來考察（見表 3）。

從方差分析結(jié)果可知，模型在 P≤0.01水平時差異顯著，因變量與所有自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=0.978 8），說明該模型能夠較好地描述實驗結(jié)果，信躁比為=15.576＞4說明用此模型可以得到足夠強的相應(yīng)信號。因此可以用模型來分析和預(yù)測懸鉤子多酚提取工藝結(jié)果。從表3中可以看出，X1、X2、X3、X12、X22、X326 項為極顯著影響因素，X1X2項為顯著響因素。通過對Y的回歸系數(shù)的檢驗可知，各因素對多酚含量提取影響的大小順序為：提取溶液濃度（X1）＞ 均質(zhì)轉(zhuǎn)速（X2）＞ 均質(zhì)時間（X3）。

2.2.4 響應(yīng)面與等高線 響應(yīng)面的圖形是響應(yīng)值對各實驗因子所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，根據(jù)擬合函數(shù)，每2個因素對提取得率畫出響應(yīng)面和等高線圖，此時考慮到定性分析各因素對多酚提取量的關(guān)系，固定另外 2個因素時，均作“0”水平處理。圖4～6為各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖。從圖中可以直觀地反映各因素對響應(yīng)值的影響，找出最佳工藝參數(shù)以及各參數(shù)之間的相互作用，從響應(yīng)面的最高點和等高線可以看出在所選的范圍內(nèi)存在極值，響應(yīng)面的最高點同時也是等高線中的最小橢圓的中心點。

表3 響應(yīng)面回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for response quadratic model

圖4 Y=f（X1，X2）的響應(yīng)面與等高線Fig.4 Responsive surfaces and contours of Y=f（X1，X2）

將建立的回歸模型中的任一因素固定在零水平，得到另外兩個因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線如圖4~6所示。隨著每個因素的增大，響應(yīng)值增大；當響應(yīng)值增大到極值后，隨著因素的增大，響應(yīng)值逐漸減小；比較3組圖可知，對多酚質(zhì)量分數(shù)影響顯著的因素，表現(xiàn)為曲線較陡；對多酚質(zhì)量分數(shù)影響次顯著或不顯著的因素，表現(xiàn)為曲線較為平滑，隨其數(shù)值的增加或減少，響應(yīng)值變化較小。在交互項對多酚質(zhì)量分數(shù)的影響中，提取溶液的濃度與高剪機轉(zhuǎn)速 （X1X2）對多酚質(zhì)量分數(shù)的影響較顯著。圖4在X1與X2交互作用等高線中，沿A軸向等高線變化密集，而B軸向等高線變化相對稀疏，說明A（X1）對響應(yīng)值峰值的影響比B（X2）大；圖6，在X2與X3交互作用等高線中，等高線密度沿 B（X2）軸方向略大于 C（X3）軸方向，說明 B（X2）和 C（X3）的交互作用中，高剪機轉(zhuǎn)速對響應(yīng)值峰值的影響大于剪切時間。

圖5 Y=f（X1，X3）的響應(yīng)面與等高線Fig.5 Responsive surfaces and contours of Y=f（X1，X3）

圖6 Y=f（X2，X3）的響應(yīng)面與等高線Fig.6 Responsive surfaces and contours of Y=f（X2，X3）

2.2.5 提取工藝條件的確定 為進一步確定最佳點，利用design-expert 7.0.0軟件對工藝條件進行優(yōu)化，可得懸鉤子多酚提取的最佳條件為：提取溶劑的體積分數(shù)：86.45%，高剪機轉(zhuǎn)速：18 218 r/min，剪切時間：221.98 s，預(yù)測多酚質(zhì)量分數(shù)能達到715.76 mg/hg。為檢驗該法的可靠性，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)修正為：丙酮體積分數(shù)：85%，均質(zhì)機功率：18 000 r/min，均質(zhì)時間：220 s。進行懸鉤子活性物質(zhì)提取的驗證實驗，經(jīng)3次平行實驗， 實際含量分別為 712.54、719.64、709.49 mg/hg，實際得率平均值為（713.89±0.66）mg/hg，可見，實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測懸鉤子提取物中總多酚的含量。根據(jù)此優(yōu)化條件，測定懸鉤子的總黃酮和花色苷的含量[10]分別為（229.97±1.37）mg/hg鮮果和（28.75±0.43）mg/hg鮮果。

3 結(jié)語

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化了冷凍均質(zhì)提取懸鉤子活性物質(zhì)的工藝，建立了多元回歸模型，模型擬合度良好。由Design-Expert7.0.0軟件分析確定了懸鉤子多酚的最佳提取條件，考慮到實際操作的便利，將最佳工藝參數(shù)修正為：丙酮體積分數(shù)：85%，均質(zhì)機功率：18 000 r/min，均質(zhì)時間：220 s。經(jīng)驗證試驗測得懸鉤子多酚質(zhì)量分數(shù)可達713.89 mg/hg，表明實驗結(jié)果與模型符合良好，說明該模型能較好地模擬和預(yù)測懸鉤子提取物中總多酚的質(zhì)量分數(shù)。在最優(yōu)條件下提取的懸鉤子提取物中總黃酮的質(zhì)量分數(shù)為229.997 mg/hg，花色苷的質(zhì)量分數(shù)為28.751 mg/hg鮮果。為下一步功能性試驗奠定良好的基礎(chǔ)。此方法工藝簡單，提取出的有效成分含量較高，采用冷凍均質(zhì)提取可有效縮短提取時間，防止有效成分損失，可用于各種漿果類提取有效成分的研究。

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