醬油發酵醬醅中耐鹽乳酸菌的分離篩選及產酸特性

黃 丹， 梁 源， 左 勇， 毛 祥， 劉有晴， 葉光斌

（四川理工學院 生物工程學院，四川 自貢 643000）

醬油在中國烹飪中占有重要的地位，在呈香、呈味、呈色等方面具有其它調味品不可替代的功能。醬油釀造是以源自大豆和小麥的植物蛋白質及碳水化合物為主要原料，生產涉及到多種有益微生物的聯合協同作用。其中最重要的是乳酸菌和酵母菌，它們的主要作用是發酵糖類產生小分子醇、醛、酸、酯、酚類等風味物質，這是醬油風味產生的主要途徑[1]。其中乳酸菌是醬油發酵體系中的主要細菌，在發酵期間，耐鹽性乳酸菌代謝產生乳酸、乙酸等種類豐富的有機酸，從而使整個發酵體系的pH值開始下降；當發酵體系的pH值下降到適宜酵母菌生長繁殖的時候，耐鹽酵母便開始大量生長繁殖，產生以醇類為主的各種小分子物質，賦予醬油特有的醇味，同時大量的醇類和部分有機酸發生酯化反應后產生酯類等風味物質，賦予醬油特有的醬香、豉香和酯香[2]。同時，乳酸菌可將精氨酸分解成鳥氨酸，并產生對絲氨酸、蘇氨酸和苯丙氨酸等進行特異性脫羰基的作用，從而左右著醬油的香氣[3]。可見，乳酸菌的代謝活動對醬油香氣和風味形成起著重要作用。目前，對乳酸菌用于醬油后發酵以促進醬油香氣和風味形成的研究很活躍，崔瑞迎等將耐鹽乳酸菌用于高鹽稀態發酵，發現醬醪中2-甲基丁酸、2-甲基丁醇、乙酸異戊酯質量分數分別較對照組高53.4%、337.3%、388.2%[4]。嚴留俊對乳酸菌增加醬油風味進行了探討性研究，確定了多菌種混合順序變溫發酵法進行醬油發酵的可行性[1]。劉卓研究了添加耐鹽乳酸菌與醬醪中的酵母的協同作用，以及耐鹽乳酸菌對發酵工藝的控制和對醬油主要風味的影響，研究結果表明，在醬醪發酵過程中，耐鹽乳酸菌的添加明顯促進T酵母的生長，而與S酵母存在著相互促進的關系[5]。可見，對醬油生產中的耐鹽乳酸菌進行分離篩選，研究其菌株特性，對于開發醬油生產中的功能微生物、提高醬油品質具有重要意義。

作者對醬油醬醅中的耐鹽乳酸菌進行了分離鑒定，并根據醬油后發酵環境條件對其菌株特性進行了研究，其結果對耐鹽乳酸菌應用于生產實踐具有重要的指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料

醬醅，由百年老字號釀造企業提供；MRS培養基，參照文獻[6]中的方法制備。

主要設備：超凈工作臺，蘇州凈化設備廠制造；H752型紫外分光光度計，上海光譜儀器有限公司制造；PHS-3C精密pH計，上海雷磁儀器廠制造；1100型PLC，美國安捷倫公司制造；HITACHI CR22G高速離心機，日本HITACHI公司制造。

1.2 方法

1.2.1 NaCl梯度平板的制備 配制MRS培養基分兩份裝，在一份MRS培養基中加入質量濃度20 g/dL的NaCl標記為A培養基，另一份標記為B培養基，121℃滅菌20 min，待培養基冷卻至50℃時，先倒A培養基于平皿內，斜置冷卻，等凝固后再倒入B培養基，平面放置冷卻。

1.2.2 耐鹽乳酸菌的富集、分離及初篩 200 mL MRS液體培養基中添加10 g/dL NaCl，加入醬醅25 g，38℃恒溫培養箱培養48 h。取富集培養液進行梯度稀釋，再吸取0.2 mL稀釋液涂布于NaCl梯度平板，38℃培養48 h。挑取處于高質量濃度NaCl區域的菌落于含碳酸鈣的MRS固體平板上劃線純化。

1.2.3 分離菌株的形態學特征 對分離菌株進行革蘭氏染色及個體形態觀察，參見文獻[6]。

1.2.4 分離菌株的16S rDNA寡核苷酸序列分析

1）菌體16S rDNA的提取：取2.0 mL的培養菌液12 000 r/min離心1 min；沉淀物加入500 μL的TE緩沖液重懸，加入30 μL體積分數10%的SDS 65℃溫浴1 h，再置于-80℃超低溫冰箱放置15 min，將離心管轉移到65℃水浴鍋放置15 min，如此重復3次，以促進細胞破裂。再于4℃6 000 r/min離心10 min，轉移上清液到2 mL的離心管中，加等體積酚-氯仿-異戊醇（體積比 25∶24∶1），劇烈振蕩5 min，靜止 10 min后，13 000 r/min離心 20 min。后將上層水相移入新的離心管中，加入0.6倍體積異丙醇，室溫沉淀 1 h，13 000 r/min，離心 20 min，棄上清液，可見黑褐色沉淀。去除殘余的異丙醇液體，加入1 000 μL體積分數70%乙醇，并轉移至2 mL的離心管內，靜置10 min，4℃，13 000 r/min離心15 min，棄上清液，去除殘余的乙醇液體，置于超凈臺吹風10 min，除盡乙醇，再入100 μL無菌水，置65℃水浴鍋水浴1 h，促進DNA的溶解。

2）16S rDNA的PCR擴增及測序：取68 μL無菌 水 、 10 μL PCR buffer、 8 μL dNTPs、 6 μL MgCl2、2 μL 1492r 引物、 2 μL 8F 引物、 2 μL Taq酶、2 μL模板于EP管中，選定ygb1擴增條件（94℃預變性 4 min，30個循環包括 94℃變性 1 min，55℃退火1 min，最后72℃延伸1 min，4℃保溫）擴增。將PCR產物純化后由上海生工生物工程技術服務有限公司測序。

3）16SrDNA序列測定及同源性比較：將測序結果輸入NCBI中與數據庫中已有的序列進行比較分析。

1.2.5 分離菌株的產酸特性 將分離菌株在MRS培養基上于38℃培養24 h，并用無菌水稀釋至菌懸液在600 nm吸光度為1，按體積分數10%接種于MRS液體培養基中，固定10 g/dL NaCl于不同溫度培養，固定溫度添加不同質量濃度NaCl，和固定前二者調不同pH的方法來進行分離菌株產酸特性研究。產酸性能用產乳酸量表示。1.2.6 乳酸含量的測定

1）樣品的處理：取20 mL發酵液于10 000 r/min、4℃下離心10 min，去除菌體后得上清液用于分析。

2）HPLC法分析：取含有乳酸的發酵上清液稀釋50倍，取稀釋液5 mL，經過0.45 μm孔徑的微濾膜過濾，得到的濾液用于HPLC分析。色譜條件：1100型PLC，色譜柱為DiamonsilTMC18；流動相組成為0.1 mol/L的KH2PO4（5%體積分數甲醇）；進樣量10 μL；體積流量0.5 mL/min；檢測器為紫外檢測器（210 nm）；柱溫為室溫。

3）乳酸的定量：將測試樣色譜圖和相同條件下的標準樣色譜圖作對比，觀察相同保留時間下乳酸特征吸收峰。根據樣品色譜圖中特征峰與標準樣吸收峰的峰面積比，求出樣品中的乳酸含量。

1.2.7 pH的測定 以無菌操作吸取少量（約5 mL）已搖勻的菌液于小燒杯中，再經校準過的精密pH計進行測定。

2 結果與討論

2.1 目的菌株的分離篩選

通過富集培養及NaCl梯度平板涂布分離，將處于高質量濃度NaCl區域的菌落于含碳酸鈣的MRS固體平板上劃線純化，根據溶鈣圈獲得產酸能力強的菌株。

2.2 分離菌株的形態學特征

分離菌株菌落呈乳白色、凸起、邊緣整齊、較濕潤。革蘭氏染色呈陽性反應，桿菌。

2.3 分離菌株16S rDNA的同源序列分析

純化的PCR產物經測序后，其16SrDNA序列在GenBank核酸序列數據庫中進行同源性比較，結果表明其與GenBank數據庫中已知菌德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus）的16SrDNA序列具有99%相似性。結合形態學特征，可以判斷為同種。菌株的16S rRNA序列有1 313 bp。序列分析結果：

2.4 分離菌株的產酸特性

2.4.1 不同發酵溫度對分離菌株產酸能力的影響將分離菌株菌懸液接入同一批含10 g/dL NaCl的MRS 液體培養基中， 分別置于 28、33、38、45、48 ℃條件下，靜置培養3 d。將培養液采用HPLC來檢測分離菌株在不同發酵溫度下的乳酸產量，結果如圖1所示。

圖1 發酵溫度對分離菌株產酸能力的影響Fig.1 Effects of temperature on the lactic acid titer by the isolated strain

溫度對乳酸菌發酵產乳酸有明顯的影響，隨著溫度的升高，乳酸產量隨之增加，38℃時達到最高，發酵液乳酸質量濃度超過3 g/dL，溫度升高超過45℃時，乳酸量開始明顯下降。因此，乳酸菌的適宜培養溫度應為38℃。可見該菌種能耐一定的高溫，在合適的溫度下產酸較快，可較好地應用于醬油的高鹽稀態發酵工藝和某些低鹽固態發酵工藝。

2.4.2 不同NaCl質量濃度對分離菌株產酸能力的影響 在同一批MRS液體培養基中分別添加NaCl，使其質量濃度為 0、4、8、12、16、18 g/dL，接入分離菌株菌懸液，38℃培養3 d，采用HPLC測定發酵液乳酸質量濃度，結果見圖2。可知，隨著環境中NaCl質量濃度增加，分離菌株產酸能力受到抑制，但在不同NaCl質量濃度下，篩選菌株代謝產生乳酸的能力相差不明顯，發酵液中乳酸質量濃度均可達到2 g/dL以上。在不同質量濃度NaCl環境中能否生長是鑒別乳酸菌是否適合醬油發酵的重要指征，此菌株能夠在高鹽環境中正常產酸的性質，說明該菌適合應用于所有醬油的發酵工藝，是一株比較優良的醬油風味發酵乳酸菌。

圖2 NaCl質量濃度對分離菌株產酸能力的影響Fig.2 Effects of NaCl concentration on the lactic acid titer by the isolated strain

2.4.3 不同環境pH值對分離菌株產酸能力的影響在同一批含10 g/dL NaCl的MRS液體培養基中，添加 HCl或 NaOH 使其 pH 調至 5.2、5.8、6.4、7.0、7.6、8.2，38℃培養3 d，結果見圖3。可知，低pH值環境不利于分離菌株乳酸的生產，在中性及偏堿性條件下都能較好地合成乳酸。

圖3 pH值對分離菌株產酸能力的影響Fig.3 Effects of pH value on the lactic acid titer by the isolated strain

而在醬油發酵過程中，醬油發酵的醬醪或醬醅初始pH接近中性，很符合該乳酸菌菌株的生長特性。且該菌株在低pH條件下乳酸代謝受到抑制，防止了在醬油發酵過程中過度地消耗還原糖等原材料造成醬油的過度酸化。該pH又接近醬油發酵中產風味酵母菌的最適生長pH，有利于下一步耐鹽酵母產醇產酯發酵的進行，比較適合醬油的發酵生產。

3 結語

通過富集培養和NaCl梯度平板法，從醬油醬醅中分離篩選出一株耐鹽乳酸菌，經16s rRNA同源序列分析并結合其形態學、生理生化特征，鑒定為德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus bulgaricus），對其進行合成乳酸特性研究，表明該菌株在NaCl 10 g/dL條件下，38℃產乳酸量可達33.68 g/L，且該菌株可耐受NaCl 18 g/dL的環境條件，在此條件下，產乳酸量仍可達22.68 g/L。同時，在中性及偏堿性條件下都能較好地合成乳酸。可見，該菌株對環境溫度、NaCl質量濃度以及pH值的耐受性均良好，表明其可較好地應用于醬油生產，對進一步提高醬油品質有重要的應用前景。不過，對于該乳酸菌菌株對醬油生產中原料蛋白質的利用率、發酵過程中各酶系的作用，以及和產香酵母菌之間的相互影響等，還有待進一步研究探討。

在醬油釀造過程中添加耐鹽乳酸菌有利于醬油風味物質的形成，提高產品品質，這已經成為行業共識。目前，應用于醬油生產的耐鹽乳酸菌主要是嗜鹽四聯球菌，而對于植物乳桿菌的研究報道還較少，所以對耐鹽植物乳桿菌進行深入研究具有重要意義。

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