烏魯木齊大氣PM2.5對質粒DNA的損傷研究

蘇都爾·克熱木拉,胡 穎,迪麗努爾·塔力甫*,邵龍義,買麗克扎提·買合木提 (.新疆大學化學化工學院,新疆 烏魯木齊 830046；.中國礦業大學資源與地球科學系煤炭資源與安全開采國家重點實驗室,北京00083)

PM2.5能夠通過呼吸等途徑進入人體,并沉積在呼吸道甚至肺泡中.又因 PM2.5可以富集、攜帶多種致癌和有毒物質,如 PAHs、重金屬元素等,對人體健康的危害非常大[1].到目前為止,關于大氣顆粒物對人體健康的影響機制有許多假說,其中一種被廣泛接受的觀點是氧化性損傷假說,即顆粒物表面生物可利用的過渡金屬離子會產生自由基,這些自由基是顆粒物產生氧化性損傷的主要原因[2-3].有研究表明,氧化性損傷是形成組織和器官纖維化的重要原因[4]和導致由吸煙引起的肺病如慢性阻塞性肺病,特別是肺氣腫的原因一致[5].

質粒DNA評價法是一種定量測量活性氧對質粒DNA氧化性損傷能力的體外方法[6],其基本原理是顆粒物表面攜帶的自由基會對超螺旋DNA產生氧化性損傷,最初引起超螺旋DNA松弛,進一步使 DNA線化.這種損傷引起不同形態DNA在電泳儀中的運動速度不同,使這些 DNA從瓊脂糖凝膠中分離開來.使用靈敏的顯像測密術測量線狀和松弛狀(被破壞)的DNA占總DNA的比例,可以定量評價顆粒物對質粒 DNA造成的損傷.

目前用質粒DNA對顆粒物毒理方面的研究主要集中在北京、哈爾濱、澳門、鄭州等城市[7-10],而對烏魯木齊大氣顆粒物研究還鮮見報道.烏魯木齊位于亞洲中心,南鄰塔克拉瑪干沙漠,北鄰古爾班通古特沙漠,市區三面被最高海拔高度為5000m 的天山圍繞,而北面的通道卻把準葛爾盆地的固體顆粒帶入市區;在長達 6個月的采暖期有 1/3的時間都被霧霾天氣所籠罩.在有關烏魯木齊 PM2.5的研究中,對其生物活性研究還鮮見報道.因此,研究利用質粒 DNA評價法檢測烏魯木齊大氣PM2.5對質粒造成破壞達到30%時所需要的顆粒物劑量(TD30),以揭示PM2.5對人體健康的影響,對認識烏魯木齊大氣 PM2.5的活性氧對人體健康的影響具有重要的意義,同時也可為烏魯木齊大氣顆粒物控制工作提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 材料

高壓滅菌的蒸餾水和 HPLC級水(Fisher,UK), X174-RF DNA(Promega,USA),溴酚藍/丙三醇染色劑和 TBE(Tris-Borate-EDTA)緩沖液(Sigma,USA),瓊脂糖(agarose),溴化乙錠(濃度為10mg/mL, AMRESCO,USA).

采樣儀器由日本產 NL20型串級式大氣顆粒物采樣頭、轉子流量計、真空泵組成,采樣濾膜為聚碳酸酯膜 (直徑為:47mm;孔徑為:0.6mm).

1.2 采樣

采樣點設在位于烏魯木齊市的新疆大學(42°45′32″N～44°08′00″N,86°37′33″E～88°58′24″E)5號樓樓頂,空氣入口與地面距離約為 15m.采樣點距烏魯木齊市主干道勝利路 200m,距新疆大學鍋爐房 500m,后臨家屬院,左右鄰教學樓,前200m范圍為綠化地帶.采樣頭設定流量為20L/min,時間設定為 24h.采樣時間為 2012年 1月～12月,共采集樣品44個.

濾膜放入恒溫恒濕箱中平衡 24h.用十萬分之一的精密電子天平(Sartorious CPA225D德國產)稱重.采樣后的濾膜恒溫恒濕 48h,再次稱重.通過差減法(采樣后的濾膜質量減去采樣前的濾膜質量)計算出顆粒物的質量濃度,具體采樣信息如表1所示.

表1 PM2.5樣品采集信息Table 1 Sample information of airborne PM2.5collected in Urumqi

1.3 質粒DNA損傷評價實驗

根據顆粒物的質量加入適量的無菌水,將樣品配成濃度為1000μg/mL的溶液,震蕩20h左右,使樣品上的顆粒物從濾膜上脫落下來.震蕩結束,取出每個樣品中的溶液將其分為兩部分,一份(全樣)放入冰箱待用,另一份在 13000r/min下離心 80min,取出上清液作為水溶樣.全樣和水溶樣每個濃度等級的總體積為50μL,其中有1.8μL的DNA(按 2μL 算),7μL 的染色劑和 41μL(41μL 溶液體積=原始溶液體積+無菌水體積),每個樣品預設定 1000,800,600,400,200μg/mL 5個濃度等級,原始溶液體積的計算公式為 1000×X=等級濃度×41.各樣品準備 6個微量離心管(5個濃度等級再加1個超純滅菌水樣)編好順序.離心管中首先加入1.8μL的X174-RF DNA(Promega,USA).再加入計算得到的原始溶液量.再加入計算得到無菌水.封口后在渦旋震蕩器上輕輕震蕩 6h.取出樣品再在離心機中離心30min后,在每一個離心管中加入 7μL的溴酚藍/丙三醇染色劑待用:將2.6g瓊脂糖和 42mLTBE 緩沖液加到500mL的錐形瓶中,再加超純滅菌水至 420mL,將錐形瓶放入微波爐加熱至溶液完全清澈后取出,等待溶液冷卻至 60℃左右時,向錐形瓶中加入10μL溴化乙錠后將錐形瓶中的溶液緩慢倒入放有 2個梳子的凝膠淺槽,每個梳孔中注入20μL樣品、X174-RF DNA和染色劑三者的混合物,并在在電泳槽兩端的溶液中各加 20μL溴化乙錠.在40V電壓和30mA電流下通電16h后,使用紫外凝膠成像系統(英國Synoptics公司)對凝膠成像.再使用Syngene Genetools軟件(英國Synoptics公司)對凝膠中不同形態DNA的光密度進行定量分析和統計(不同顆粒物劑量對DNA的損傷要減去H2O對質粒DNA的損傷),根據不同濃度等級顆粒物造成的 DNA損傷量進行線性回歸,得出造成 30%DNA損傷的顆粒物的濃度,即TD30值.TD30值越小,則該顆粒物對質粒 DNA的氧化性損傷能力越強,對人體健康影響越大.實驗過程在中國礦業大學煤炭資源與安全開采國家重點實驗室(環境與健康實驗室)完成.

2 結果與討論

2.1 PM2.5質量濃度分析

由表 1可見采樣期間,烏魯木齊大氣 PM2.5的質量濃度最大值為150.58μg/m3,出現在1月24日,最小值為 21.18μg/m3,出現在 5月 13日.1月24日是中國農歷的大年初二,因為鞭炮燃放等原因造成當天的烏魯木齊大氣PM2.5的質量濃度最大.在全年采集的樣品中 1/4樣品的質量濃度高于或等于國家標準(75μg/m3).

就季節性分布而言(圖 1),冬季(12、1、2月份)PM2.5質量濃的日平均值為 66.13μg/m3,春季(3、4、5月份)PM2.5質量濃的日平均值為60.85μg/m3,夏季(6、7、8 月份)PM2.5質量濃的日平均值為 45.91μg/m3,秋季(9、10、11月份)PM2.5質量濃的日平均值為 60.64μg/m3.可以得出 PM2.5的質量濃度冬季最高,其次是春季和秋季,夏季最低,春季和秋季的平均值差別不大.

圖1 烏魯木齊PM2.5的質量濃度的季節性變化Fig.1 Seasonal variation of mass concentrations of PM2.5 in Urumqi

由于烏魯木齊霧霾天氣主要集中出現在冬季,使得大氣光照較弱、日照時間短、逆溫出現頻率增大、大氣對流不活躍等不利于空氣中污染物質擴散的因素較多,從而導致顆粒物濃度較高.而 6～8月是較典型的夏季季節,溫暖、濕潤雨量充滯,雨水的沖刷及其他氣象因素使得大多時候空氣的質量較好[11].

2.2 PM2.5對質粒DNA的氧化性損傷

2.2.1 不同季節 DNA 的氧化性損傷 烏魯木齊大氣不同季節 PM2.5全樣和水溶部分的 TD30值如表2所示.

表2 烏魯木齊市PM2.5樣品的全樣和水溶部分的TD30值(μg/mL)Table 2 TD30 of whole sample and corresponding watersoluble fraction of PM2.5 collected from Urumqi in different seasons (μg/mL)

由表2可見,同一采樣點不同季節不僅TD30值差異較大,而且全樣和水溶部分對質粒 DNA的氧化性損傷也有差異.全樣對質粒 DNA的氧化性損傷出現冬季最大,春季和夏季次之,秋季最低的季節性變化特征.

冬季 PM2.5全樣和水溶部分樣的 TD30值的平均值分別為 440,474μg/mL,最低可以觀測到的值分別為35,43μg/mL;秋季全樣和水溶部分樣的平均值分別為535,600μg/mL;春季平均值分別為491,721μg/mL;夏季平均值分別為 503,666μg/mL.可以看出,烏魯木齊大氣 PM2.5無論是全樣還是水溶部分樣對質粒DNA的氧化性損傷均具有冬季最大,秋季最低的季節性變化特征.

造成這種季節性差異的可能原因是冬季靜風頻率高、逆溫層厚、污染物較長時間不易擴散,再加上燃煤、汽車尾氣等排放的大量燃煤飛灰和煙塵集合體長時間漂浮在大氣中[12],吸附了大量的有毒有害物質,從而導致冬季 PM2.5對質粒DNA的氧化性損傷較大.而烏魯木齊秋季氣候較干燥,風速較大,不利于污染物的聚集和有毒有害物質的吸附.

2.2.2 特殊氣象條件下的PM2.5對質粒DNA的氧化性損傷 表2中的樣品5-26和6-13是在陣雨過后采集,因此,兩個樣品全樣和水溶部分樣的TD30值分別為 1620,247,1570,601μg/mL,即兩個樣品全樣的 TD30值在所有樣品中最大,對質粒DNA 的氧化性損傷最小.另外,兩個樣品全樣的TD30值是水溶部分樣的6.6和2.6倍,可能是由于降水的作用加速了大氣中水溶性離子的形成使得吸附于顆粒相中的水溶性離子增多,而使得水溶部分樣的TD30值小.

2.2.3 PM2.5全樣和水溶部分對質粒DNA的氧化性損傷差異分析 一般認為,大氣 PM10的肺毒性來自水溶組分[7].而Imrich等[13]研究指出,濃縮的大氣顆粒物中的不可溶部分引起了肺泡巨噬細胞(AM)的生物反應.由圖 2可見,2012年全年采集樣品除以上兩個特殊樣品外,同一樣品的全樣和水溶樣TD30值相差較大,絕大部分樣品全樣的 TD30值均小于水溶部分樣的 TD30值,表示全樣的毒性大于相應的水溶部分樣.

圖2 PM2.5樣品的全樣和水溶部分的TD30值Fig.2 TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction of PM2.5

2.2.4 TD30值與氣象因素的相關性分析 為了探明氣相因素(大氣溫度、濕度、風速)對 PM2.5氧化性損傷能力的影響,選用SPSS軟件對PM2.5樣品的全樣及水溶部分的TD30值與氣相因素之間進行了相關性分析,其結果如表3所示.

由表3可以看出,全樣TD30值與平均溫度在0.05水平上顯著正相關,即采樣時溫度越高全樣TD30值越大,全樣的氧化損傷能力越小;但全樣TD30值與平均風速、相對濕度之間沒有相關關系;水溶樣TD30值與平均風速和相對濕度之間的相關性概率P＜0.01,說明相關性非常顯著,而且水溶樣 TD30值與平均風速正相關,即風速越大TD30值越大顆粒物的氧化性損傷能力就越小;水溶樣TD30值與相對濕度是負相關,及相對濕度越大TD30值越小,濕度越大顆粒物的氧化性損傷能力就越大.水溶樣TD30值與平均溫度之間沒有相關關系.

2.3 TD30值與相應質量濃度的相關性分析

可吸入顆粒物的質量濃度不僅是流行病學調查研究的基礎,也是目前空氣質量的主要標準之一.從圖 3可知,無論是全樣還是水溶樣的TD30與質量濃度之間沒有明顯的相關趨勢.若顆粒物的質量濃度對氧化損傷起決定作用,那么應該 TD30值隨濃度的增大而減少,但結果并非完全如此.

對全樣來說,以樣品 1-24和 12-30為例,當PM2.5的質量濃度高達 150.58μg/m3時,全樣的TD30值高達 450μg/mL,即該樣品氧化性損傷能力反而小;當 PM2.5的質量濃度等于 48.51μg/m3時,全樣的TD30值為35μg/mL,表現出較大的氧化性損傷能力.而對樣品 8-4來說,質量濃度只有24.3μg/m3,但其全樣的 TD30值為 270μg/mL,樣品2-28、4-11、10-2、11-1、12-24等均出現相似的情況.

表3 PM2.5全樣和水溶樣TD30值與環境因素的相關性Table 3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding environmental factors

圖3 PM2.5全樣和水溶樣TD30值與其質量濃度之間的關系Fig.3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding Massconcentrations

就水溶樣來說,以樣品4-22、7-7和1-24為例.當 PM2.5的質量濃度等于 57.64μg/m3時,水溶樣的TD30值為1758μg/mL,即該樣品的氧化性損傷能力很小;當質量濃度等于34.38μg/m3時,水溶樣的TD30值為69μg/mL,表現出較大的氧化損傷能力.對樣品 1-24來說,其質量濃度高達150.58μg/m3時,水溶樣的 TD30值只等于480μg/mL,其損傷能力居中.但也有部分樣品出現質量濃度和TD30值成正比或成反比的情況,如樣品1-4、1-11、1-21都是隨著質量濃度的減少其 TD30值也減少,即氧化性損能力傷增大;而樣品 1-31、2-1、2-14隨著質量濃度的增大TD30反而減少,即氧化性損傷能力增大.因此僅以顆粒物的質量濃度來評價大氣顆粒物氧化性損傷能力大小的方法并不能真實地反映其對人體健康的危害程度,其決定作用的還是顆粒物的化學組成及其表面吸附的有害成分[14].

3 結論

3.1 采樣期間 PM2.5的質量濃度最大值為150.58μg/m3,最小值為 21.18μg/m3.2012年烏魯木齊 PM2.5的質量濃度冬季最高,其次是春季和秋季,夏季最低,春季和秋季PM2.5的質量濃度差值不大.

3.2 PM2.5全樣對質粒DNA的氧化性損傷冬季最大,春節和夏季次之,秋季最低;PM2.5水溶部分樣對質粒DNA的氧化性損傷具有冬季最大、夏季次之、春節較低,秋季最低的季節性變化特征.絕大部分 PM2.5樣品全樣的的 TD30值小于水溶部分樣的TD30值.

3.3 在陣雨后采集的兩個樣品的全樣和水樣分別 D30值分別為 1620μg/mL 和 1570μg/mL,明顯大于相應的水溶部分的 D30值 601μg/mL、247μg/mL.

3.4 全樣 TD30值與平均溫度在 0.05水平上顯著正相關,即溫度越高全樣 TD30值越大,氧化損傷能力越小.水溶樣TD30值與平均風速在0.01水平上顯著正相關,與相對濕度顯著負相關,說明風速越大顆粒物的氧化性損傷能力就越小,濕度越大顆粒物的氧化性損傷能力就越大.

3.5 PM2.5的氧化性損傷能力與相應的質量濃度之間沒有明顯的相關性.

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