加熱和冷卻速率對大豆蛋白凝膠特性的影響

武 肖 傅玉穎 潘偉春 關鵬翔 盧錦麗

(浙江工商大學食品與生物工程學院，杭州 310035)

各種來源的球蛋白因其良好的營養價值和對食品質構的影響在食品工業中具有重要的作用［1］。這種質構特性由蛋白質交聯形成的凝膠網絡結構決定，所以凝膠作為球蛋白的一種非常重要的功能特性常用來改善食品質構［2］。蛋白凝膠網絡結構受到多種外部因素影響。理論上，pH、離子強度、加熱溫度和加熱速率是影響球蛋白凝膠網絡結構的重要因素［3－5］;現實中，他們也是食品工業中用來調控蛋白質凝膠結構的常用加工參數。

小變形振蕩(動態)流變測試是評價蛋白質凝膠性質和結構的一種非常有效的方法，它對樣品物理結構和化學組成的改變極其敏感，非常適合考查凝膠形成過程中的一些微小變化［6－7］。高儲能模量表示分子間有更多的相互作用和很強的網絡結構，而低的tanδ表示更好的三維網絡結構［8］。

目前，大量研究集中于pH、離子強度和溫度對蛋白質凝膠結構的影響，而加熱和冷卻速率對蛋白質凝膠結構和性質影響的報道較少，特別是冷卻階段對蛋白質凝膠結構和性質具有很大的影響。Sun等［9］發現慢的加熱速率對豌豆球蛋白凝膠有不利的影響，而較慢的冷卻速率能夠增加蛋白質凝膠的強度。本試驗意在探討加熱和冷卻速率對大豆蛋白熱誘導凝膠特性的影響，以期為大豆蛋白的開發利用提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

低溫脫脂豆粕:山東萬得福集團實業有限公司。

1.2 儀器與設備

安東帕MCR 302流變儀:奧地利安東帕(中國)有限公司;高速冷凍離心機(H1850R型):湖南湘儀離心機儀器有限公司;pH計(PHS－3C型):上海理達儀器廠;冷凍干燥機(FD－1C－50型):北京博醫康實驗儀器有限公司;半微量凱氏定氮儀(KJ2300型):福斯中國有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 大豆分離蛋白的制備

采用堿溶酸沉法制備大豆分離蛋白(SPI)，將低溫脫脂豆粕按1∶15的比例與去離子水混合，室溫攪拌2 h后9 710 r/min離心30 min，取上清液用1 mol/L HCl調pH至4.5(等電點)，4℃下靜置2 h后8 690 r/min離心10 min，取蛋白凝乳重新溶于去離子水中，1 mol/L NaOH調節pH至中性，然后以9 710 r/min下離心30 min除去少量不溶物，透析48 h后冷凍干燥。測其蛋白質質量分數為92.5%(N×6.25)。

1.3.2 流變分析

將SPI溶于去離子水中配成12%的溶液，充分溶解后，使用流變儀進行動態振蕩分析，所用轉子為同軸圓筒雙間隙(型號:DG26.7)，約5 mL樣品倒入圓筒中，待轉子到達測量部位時，在樣品表面滴加少許硅油以防水分揮發。

分析測試程序:樣品在25℃下平衡2 min，溫度范圍25℃～95℃～25℃(從室溫到95℃，足夠使大豆蛋白變性且常用于食品工業中)，加熱和冷卻速率分別為 4、2、1、0.5 ℃ /min，應變為 1%，頻率 1 Hz。隨后對樣品進行頻率掃描:25℃下0.01～10 Hz。收集每個樣品儲能模量(G')、耗能模量(G″)和 tanδ(G″/G')，取1 Hz時數據比較形成凝膠的特性。所設應變值在熱誘導蛋白網絡結構的線性黏彈區內(預試驗所得)。每個樣品測3次。

凝膠點是凝膠開始形成時的溫度，本試驗采用加熱階段G'快速增加時G'與G″交點的溫度作為大豆蛋白的凝膠點。

1.3.3 數據處理

試驗數據均進行3次重復試驗，采用SPSS軟件進行分析，測定結果以均值±標準差表示。試驗數據采用ANOVA和Duncan分析(95%置信區間)。

2 結果與討論

2.1 大豆蛋白典型凝膠形成模型

大豆蛋白典型的熱誘導凝膠形成曲線見圖1，每個樣品測試(3次)獲得的流變圖譜從本質上來說是完全一致的。從圖1中的3個參數(G'、G″、tanδ)可以看出大豆蛋白凝膠網絡結構形成過程中流變性質的改變。G'表示蛋白質凝膠網絡結構的彈性組成，代表了凝膠結構的強度，對凝膠三維網絡結構有貢獻;G″表示黏性組成，對三維網絡結構沒有貢獻。Tanδ值象征著網絡結構形成的類型，其值越小代表三維網絡結構越好。

圖1a可以看出，在加熱階段溫度升至80℃前G'和G″基本保持恒定。在此過程中，蛋白質分子逐漸變性(去折疊)、疏水基團暴露是凝膠形成的準備階段。當加熱溫度超過85℃后，G'和G″快速上升表明凝膠網絡結構逐步形成。凝膠過程初始階段黏性行為占主導地位(G″＞G')，而在加熱后期彈性行為占據主導地位(G'＞G″)，此時蛋白質分子聚集并且交聯形成三維網絡結構，此過程為初始凝膠階段;當溫度達到最高95℃后，冷卻階段開始。在此過程中，G'和G″繼續穩定增加，說明蛋白質分子繼續交聯、凝膠網絡結構緩慢形成和重排。Paulson等［10］把油菜蛋白凝膠的形成和穩定性歸因于疏水相互作用和氫鍵。因此，可以認為疏水相互作用和氫鍵對大豆蛋白凝膠的形成和穩定性起到同樣作用。Tanδ是辨別凝膠構造的一個非常重要的參數。從圖1b可以看出，在85℃之前tanδ逐漸下降，在90℃左右時急劇下降至一個非常低的水平，并且在以后的加熱和冷卻階段保持恒定。這說明在冷卻初始階段大豆蛋白溶液已經形成了穩定的凝膠，并且在冷卻過程中同時增加了網絡結構的彈性和黏性組成。

圖1 典型的大豆蛋白凝膠形成G'，G″模形圖和tanδ模型圖

圖1所示凝膠過程遵循球蛋白熱誘導凝膠3步過程:1):蛋白變性以及疏水基團暴露;2)去折疊的蛋白質分子間相互作用(聚集);3)聚集體交聯成網絡結構。特別強調的是在冷卻階段，凝膠網絡結構繼續發展并且被形成的許多短程鍵(如氫鍵)加強。因此，可以總結大豆蛋白溶液凝膠網絡形成主要是疏水相互作用和氫鍵。

對于所有的加熱和冷卻速率，加熱階段所得的流變曲線基本相同，G'和 G″都小于1 Pa，且 G'＜ G″直到到達凝膠點(圖1)。所以比較加熱和冷卻速率對冷卻階段大豆蛋白凝膠性質的影響。

2.2 加熱速率對冷卻階段凝膠形成G'值的影響

從圖2a可以看出，在冷卻速率均為2℃/min的情況下，加熱速率越慢，冷卻階段形成的凝膠G'值越大。這可以解釋為在相同冷卻速率下，較慢的加熱速率使大豆蛋白分子有更多的時間去重排和交聯形成更有序的網絡結構來增加凝膠強度。這與前述Sun等［9］的研究結論不同，他們發現慢的加熱速率對豌豆蛋白凝膠形成有不利的影響，這種差異可能是不同的蛋白種類造成的。

圖2 不同加熱和冷卻速率對冷卻階段大豆蛋白溶液的影響

圖3a表示不同加熱速率下熱誘導大豆蛋白凝膠的性質。較慢加熱速率(0.5、1℃/min)的G'顯著大于較快加熱速率(2、4℃/min)下形成凝膠的G'值，4℃/min時tanδ顯著高于其他較慢加熱速率時的值。Renkema等［11］認為不同的加熱速率影響蛋白質的聚集動力學導致產生不同網絡結構(不同粗細的線股、孔隙等)的凝膠，而不同的網絡結構又導致不同的G'值。

圖3 12%大豆蛋白凝膠形成后頻率掃描1 Hz時熱誘導凝膠性質

2.3 冷卻速率對冷卻階段凝膠形成G'的影響

圖2b表示冷卻速率對大豆蛋白凝膠形成的影響。在相同加熱速率下，最慢的冷卻速率(0.5℃/min)時大豆蛋白形成最強的凝膠強度。這是因為慢的冷卻速率使蛋白質分子有更長的時間處于去折疊態，放緩了暴露基團的活動性，使其在蛋白質分子相互作用前達到最佳的排列。氫鍵是促進大豆蛋白凝膠結構形成的重要因素，較低的溫度則有利于氫鍵的形成，因此可以推測慢的冷卻速率促進氫鍵的形成從而產生更強的凝膠。O'Kane等［12］報道在慢的冷卻速率(0.2℃/min)下疏水作用和二硫鍵與豌豆蛋白的凝膠結構有關，他們認為慢的冷卻速率為巰基基團反應形成二硫鍵提供了充足的時間，凝膠強度增加。眾所周知，親水性氨基酸如天冬氨酸、谷氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的側鏈上極性基團可以形成氫鍵并且為去折疊蛋白質分子提供鏈接。對于疏水相互作用，非極性氨基酸如丙氨酸、甘氨酸等在球蛋白變性時從分子內部暴露出來而更容易形成。

圖3b表示冷卻速率對熱誘導大豆蛋白凝膠性質的影響。隨著冷卻速率的增大，G'值減少。Tanδ在較慢冷卻速率時(0.5、1、2℃/min)和快速冷卻速率時(4℃/min)有顯著不同。這是因為在冷卻階段，隨著溫度的下降大豆蛋白分子活動性下降，促進了分子之間化學鍵的形成;慢的冷卻速率下大豆蛋白有充足的時間形成各種作用力從而增大了G'，而較快的冷卻速率則減少了各種作用力的形成從而降低了凝膠的強度，產生了不同的網絡結構類型。與加熱速率對凝膠性質的影響相比，冷卻速率對大豆蛋白凝膠性質的影響相對較大。

2.4 加熱和冷卻速率對冷卻階段凝膠形成G'值的影響

加熱和冷卻速率對大豆蛋白凝膠性質同樣有顯著的影響，如圖2c，慢的加熱和冷卻速率比快的加熱和冷卻速率形成的凝膠更強。值得注意的是，在較慢加熱和冷卻速率(0.5、1℃/min)下，G'在冷卻階段初期較大，然后隨著溫度的降低緩慢增大;在較快加熱和冷卻速率(2、4℃/min)時，G'在冷卻初期急劇增大，然后逐漸放緩。這種情況是由于在快的加熱和冷卻速率時，凝膠網絡結構在冷卻階段繼續形成，而慢的加熱和冷卻速率時，凝膠網絡結構在加熱階段形成冷卻階段加強。

改變加熱和冷卻速率同樣影響大豆蛋白凝膠網絡結構，見圖3c。G'隨著加熱和冷卻速率的增大逐漸減少，而tanδ則逐漸的增大。對于G'，其逐漸減少和加熱(冷卻)速率對蛋白凝膠性質的影響相一致(見圖3a和圖3b)，進一步證明了慢的加熱(冷卻)速率增強了蛋白質分子之間的相互作用并產生了更強的凝膠。而對于網絡結構類型(tanδ決定)，同樣受到加熱和冷卻速率的影響，快的加熱和冷卻速率形成的tanδ較大，說明凝膠網絡結構中黏性組成較大，這與圖3a和圖3b的結果相一致。

2.5 加熱和冷卻速率對凝膠點的影響

加熱和冷卻速率對凝膠點的影響結果如表1所示。隨著加熱速率的增大凝膠點增大，和冷卻速率無關。這與O'Kane等［12］的結果相一致，他們發現在較慢的加熱速率下豌豆蛋白初始凝膠形成的溫度較低。Renkema等［11］發現大豆蛋白在較快的加熱速率時其變性溫度較高，這就導致較高的凝膠溫度。雞蛋清蛋白、豌豆球蛋白和牛血清蛋白中有同樣的現象［13－14］。因此，可以得出凝膠點和加熱速率有關。在較低的加熱速率下蛋白質分子有更多的時間重組和排列，因此，他們在較低溫度下開始交聯;在較高加熱速率下，蛋白質分子沒有足夠的時間去重組和排列，因此，開始交聯時溫度較高。

冷卻速率對凝膠點無影響，如表1結果所示。在相同加熱速率不同冷卻速率下，蛋白質有相似的凝膠點。當加熱和冷卻速率都改變時，凝膠點只受加熱速率影響。

表1 加熱和冷卻速率對凝膠點的影響(SPI 12%)/℃

2.6 不同濃度對大豆蛋白凝膠性質的影響

蛋白質濃度對SPI凝膠性質的影響見表2(加熱和冷卻速率2℃/min)。G'值隨著蛋白質濃度的增大(從10%～15%)而增大，因為濃度的增大提高了蛋白質分子交聯的機會從而形成了更強的凝膠構造。Tanδ隨著蛋白質濃度的增大而減少，說明高的蛋白質濃度形成了三維網絡結構更好的凝膠。凝膠點隨著蛋白質濃度的增大從95℃降低到72℃，在P＜0.05水平上呈顯著性差異，說明凝膠點和蛋白質的濃度相關;這與Sun等［15］的研究結果不同，他們發現鹽溶豌豆蛋白的凝膠點與濃度無關。這可以解釋為在相同的溫度下濃度高的蛋白質有更多的機會交聯，所以高濃度的蛋白質溶液在較低的溫度下就開始形成凝膠。

表2 不同濃度對大豆蛋白凝膠性質的影響

3 結論

加熱和冷卻速率影響熱誘導大豆蛋白的凝膠性質和結構。在相同冷卻速率下(2℃/min)，隨著加熱速率的增大(從0.5～4℃/min)，凝膠點逐漸增大而凝膠強度逐漸減小;在相同加熱速率下(2℃/min)，隨著冷卻速率的增大(從0.5～4℃/min)，最終凝膠強度逐漸減小而凝膠點基本保持不變。慢的加熱(冷卻)速率形成更小的tanδ，表明形成更好的三維網絡凝膠結構;慢的加熱(冷卻)速率產生更大的G'值，表明形成更強的凝膠強度;而凝膠點隨著加熱速率的增大而增高，與冷卻速率無關。增大蛋白質濃度可以提高凝膠強度，而tanδ值和凝膠點隨著蛋白質濃度的增大而減少。因此，在食品生產中可行的途徑是調控加熱和冷卻速率以控制大豆蛋白的凝膠強度，生產出最適的凝膠特性，而不用改變蛋白質的濃度。

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