低溫脅迫下鹿蹄草生理響應變化分析

李文馨　孫彩玉　胡海清等

摘要 [目的]探尋低溫脅迫對鹿蹄草的影響機制。[方法]以鹿蹄草葉片為材料，測定不同冷處理條件下葉片各種保護酶（SOD、POD、CAT）、丙二醛、葉片相對電導率、脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖等含量變化情況。[結果]葉片的SOD酶與POD酶均呈現先升后降的趨勢，但變化幅度不盡相同；CAT酶則呈現先降后升的趨勢，但變化幅度不大。丙二醛的積累與葉片相對電導率均呈現上升趨勢。脯氨酸、可溶性蛋白質和可溶性糖含量隨脅迫時間增加呈現出明顯的相關性。[結論]該方法研究了低溫脅迫對鹿蹄草的影響，為鹿蹄草的合理利用提供了依據。

關鍵詞 鹿蹄草（Pyrola.calliantha H.Andres）；低溫脅迫；生理響應

中圖分類號 S567 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01361-04

Abstract [Objective] To explore the influence mechanism of low temperature stress on Pyrola calliantha. [Method] The content changes of various protective enzymes （SOD， POD， CAT）， malondialdehyde， leaf relative electrical conductivity， proline acid， soluble protein， soluble sugar in different cold treatments were determined. [Result] The results showed that： leaf SOD and POD enzyme activity were first increased and then decreased， but not the same amplitude， CAT activity is decreased first and then increased， but changes slightly. MDA accumulation and the relative conductivity of leaves are on the rise. Proline， soluble protein and soluble sugar contents show a significant correlation with stress time increasing. [Conclusion] Effects of low temperature stress on Pyrola calliantha were studied， which will provide a reference for reasonable utilization of Pyrola calliantha.

Key words Pyrola calliantha H.Andres； Low temperature stress； Physiological response

鹿蹄草（Pyrola.calliantha H.Andres）屬于鹿蹄草科（Pyrolaceae）鹿蹄草屬（Pyrola L. ）多年生小型草本植物，根莖細長，葉常基生，花聚成總狀花序。鹿蹄草屬植物全世界約有30余種，主要分布于北半球的溫帶和寒溫帶地區。我國是其主要分布區，并且種類繁多，共有27種3變種，主要集中分布在西南的四川、云南、貴州、西藏等省和東北的黑龍江大、小興安嶺、吉林長白山地區等[1]。中醫學上早就將其作為一種中草藥使用。結果表明，鹿蹄草在醫學上具有良好的藥效。隨著中醫學對鹿蹄草的深入研究和廣泛應用，其作用效果日益為人們所了解和重視，從而引起世界性的關注目前，主要是對鹿蹄草的分布狀況、化學成分、醫學功能及應用等領域進行了研究[2]。

溫度是植物生存和生活的基本環境條件之一，低溫是限制植物地理分布的主要因子[3]。鹿蹄草主要分布于我國東北地區，是寒溫帶針闊混交林的指示植物，抗逆性較強，冬季仍然存活，在寒地區形成了獨特的適應寒冷的機制。目前，對于鹿蹄草抗寒研究鮮有報道。筆者通過測定低溫脅迫后的鹿蹄草中SOD、POD、CAT活性及丙二醛、葉片相對電導率、脯氨酸、可溶性蛋白和還原糖等含量變化情況，以期為闡明鹿蹄草對低溫的適應性規律提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

研究對象。鹿蹄草植株，采自五大連池老黑山地區。移栽入盆，用營養土進行培養，后取長勢相同植株移入4 ℃人工氣候箱進行低溫脅迫處理。

1.1.2

主要試劑。所用試劑均為國產分析純，市售。

1.2 方法

1.2.1

樣品的預處理。設置的低溫為4 ℃，連續梯度時間低溫脅迫。脅迫時間分別為0、2、4、6、8和10 d 6個梯度。分別取長勢一致并無蟲害的葉片，用清水洗去表面殘留泥土，再用去離子沖洗2遍。將葉片表面殘留水分吸干，將葉片切成約0.5 cm2小塊，存于錫紙包內，每包0.50 g，液氮冷凍，置于-80 ℃保存，以待備用。

1.2.2

試驗地點選擇。鹿蹄草材料的低溫處理在東北農業大學生命中心實驗室4 ℃人工氣候培養箱進行；相關生理指標的測定分析在生命中心實驗室及實驗樓植物生理實驗室完成。

1.2.3

生理指標的測定方法。超氧化物歧化酶（SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）法[4]。過氧化物酶（POD）活性活性測定采用愈創木酚法[5]。CAT活性的測定采用紫外吸收法測定[6]。可溶性蛋白質含量采用考馬氏亮藍G-250染色法[7]。可溶性糖含量用蒽酮比色法測定[8]。脯氨酸含量測定采用茚三酮比色法[9]。MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法[10]。質膜相對透性采用DDS-310型電導儀測定。

1.2.4

數據處理。試驗數據采用SPSS17.0進行統計和分析，Excel2003進行制圖。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對鹿蹄草SOD、POD和CAT活性的影響

2.1.1

低溫脅迫處理對SOD的影響。SOD是植物體內重要的保護酶之一，能夠有效的清除體內的自由基[11]。圖1表明，4 ℃低溫脅迫下植物體內的SOD活性先增高再降低，當低溫脅迫時間達到6 d時，SOD酶活性最高，約為初始活性。但隨脅迫時間的延長，SOD酶活性大幅度下降。未經脅迫處理的（0 d）與脅迫處理6 d之間的SOD酶活性差異極顯著（P<0.01），與脅迫處理2 d的SOD酶活性差異不顯著（P>0.01），與脅迫處理4、8和10 d的SOD酶活性差異顯著（P<0.05）。

2.1.2

低溫脅迫處理對POD的影響。POD作為植物保護酶之一，能夠防御外界不良環境，其活性與植物的抗寒性呈有一定的關系[12]。當植物體遭受逆境脅迫時，POD酶可將過剩的H2O2分解為H2O和O2，從而減輕活性氧對植物造成的傷害。圖2表明，低溫脅迫使植物體內的POD活性呈現增加趨勢，并隨著脅迫時間增加而活性增強。當脅迫時間在2～6 d，POD酶活性呈現大幅度上升趨勢，并在脅迫6 d時達到最大值；但脅迫時間繼續延長時，在6～8 d，POD活性呈現下降趨勢。未經脅迫處理的（0 d）與脅迫處理6 d的POD酶活性達到差異極顯著（P<0.01），與脅迫時間為2 d時間差異不顯著（P>0.01），與4、8和10 d的差異顯著（P<0.05）。脅迫時間為2 d與脅迫4、8和10 d時間的POD酶活性差異顯著（P<0.05）；與脅迫6 d的POD活性呈現極顯著（P<0.01）。

2.1.3

低溫脅迫處理對CAT的影響。CAT酶是膜脂過氧化防御系統的重要組成部分，能夠在逆境脅迫或衰老過程中減少OH-的形成，保護膜的結構，減輕毒害，從而使植物忍耐、減緩或抵抗逆境脅迫或延緩器官的衰老 [13]。CAT酶是植物在低溫脅迫下清除體內H2O2的關鍵酶。圖3表明，與SOD酶和POD酶活性相比較，CAT酶出現了低溫脅迫活性先降低后升高的趨勢，但CAT酶活性隨著脅迫時間而降低并且低于脅迫處理0 d的CAT酶活性。在脅迫時間達到6 d時，CAT活性出現最低值，并與脅迫處理0 d的CAT酶活性呈現顯著性差異（P<0.05）。

2.2 低溫脅迫處理對丙二醛（MDA）含量和相對電導率的影響。

2.2.1

低溫脅迫處理對MDA含量的影響。MDA是膜脂過氧化作用的終產物，是膜系統受傷害的重要指標[14]，積累的多少，表明組織的保護能力強弱，細胞膜遭受破壞是否嚴重。MDA含量的多少能夠代表質膜受傷害的程度[15]。因此，MDA可以作為判斷植株抗冷害能力的指標之一[16]。圖4表明，低溫脅迫下，鹿踢草葉片MDA含量出現先上升趨勢后下降的趨勢。在脅迫時間達到8 d時，MDA含量達到最高。當脅迫時間繼續延長至10 d的過程中，MDA又出現了下降趨勢。但MDA含量在變化過程中幅度不如其他生理指標變化幅度大。并且各個時間點呈現出不顯著差異。

2.2.2

低溫脅迫處理對電解質滲漏率的影響。電解質滲漏率是衡量細胞組織和細胞質膜的幼嫩程度和是否收到傷害的指標[17]。研究表明，植物受到低溫脅迫時，會引起細胞原生質結構的破壞，導致細胞原生質透性增大，而透性越大，離子滲漏率越高，說明受到的傷害越重，抗寒性也就越弱[18]。圖5表明，隨著低溫時間的加長，植物體葉片電解質滲漏率隨時間的增加而變大，當脅迫時間達到8 d時，電解質滲漏率達到最高。當脅迫時間繼續延長至10 d的過程中，電解質滲漏率又出現了小幅度下降趨勢。但在脅迫過程中，植物體電解質滲漏率變化幅度不大，為緩慢增大過程。并且各個脅迫時間點其電解質滲漏率呈現不顯著差異。

2.3 低溫脅迫處理對可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的影響

2.3.1

低溫脅迫對可溶性蛋白的影響。蛋白質含量的增加，有助于提高細胞內的束縛水含量，降低冰點，從而成為防止細胞內結冰、避免細胞冰凍死亡的原因之一[19]。研究表明，低溫脅迫下，植物可溶性蛋白質含量增加[20-22]。因為可溶性蛋白的親水性質強，能增強細胞持水力，因而在低溫脅迫下，植物體內可溶性蛋白質升高有利于抗冷性的提高。多數情況可溶性蛋白質和總蛋白質的含量與抗寒之間存在正相關。這表明，低溫脅迫能引起植物基因表達發生改變，并有新的蛋白質合成，參與抗寒性發育過程[23-24]。圖6表明，在低溫脅迫的整個過程中，植物體內可溶性蛋白含量在不斷身高，當脅迫是時間累計到8 d時，可容性蛋白含量達到最高，當脅迫時間繼續延長至10 d時，可容蛋白含量有所下降，但下降幅度不大。未經脅迫與脅迫的各個時間點呈現出差異不顯著（P>0.05），且各個時間點均呈現不顯著差異（P>0.05）。在整個低溫脅迫的過程中，可溶性蛋白的含量變化幅度較小。

2.3.2

低溫脅迫對可溶性糖的影響。植物體內可溶性糖的含量與植物對低溫脅迫的抵抗力關系密切[25]。糖是植物代謝的基礎物質，可為脯氨酸的合成提供必需的氧化還原能力，植物體內糖含量的變化是低溫脅迫條件下植物代謝敏感較高的生理指標之一[26]。大量研究表明，植物在低溫鍛煉過程中，細胞內可溶性糖含量增加，解除鍛煉時降低，而且可溶性糖含量的增加是與淀粉水解相平行的[27-31]。圖7表明，可溶性糖含量與可容性蛋白含量保持基本走勢相同，但可溶性糖含量在脅迫時間達到6 d達到最高值，與未經脅迫時間點可容性糖含量差異顯著（P<0.05）。并在可溶性糖含量達到最高后保持基本穩定的含量。

2.3.3

低溫脅迫對脯氨酸的影響。游離脯氨酸具有水溶性和水勢高，在細胞內積累無毒等特點，因而在植物低溫脅迫過程中能作防脫水劑而保護植物[32]。一般情況下逆境中的植物其體內的脯氨酸會大的積累，這是植物對不良環境的一種適應性反映[33]。脯氨酸的積累是由植物體內脯氨酸生物合成激活和脯氨酸降解的抑制共同導致的[34-36]，并非是單因子影響。圖8表明，脯氨酸酸含量在脅迫8 d時達到最高值。在0～8 d時，脯氨酸含量隨著脅迫時間的增加而增加；當脅迫達到高峰時，可溶性糖含量有所降低。未經脅迫的脯氨酸含量與脅迫8 d的可溶性糖含量呈現出極顯著差異（P<0.01）。0 d與6 d、10 d的脯氨酸含量呈現顯著性差異（P<0.05）。0 d與2 d、2 d與4 d的脯氨酸含量呈現出不顯著差異（P>0.05）。

3 結論與討論

鹿蹄草主要分布于我國東北地區，喜陰，是寒溫帶針闊混交林的指示植物，抗逆性較強。當受到低溫脅迫時，鹿蹄草本身的某些生理指標有了明顯變化。試驗結果表明，SOD酶和POD酶的活性均隨著脅迫時間的累計而呈現先升后降的趨勢，在脅迫6 d時達達到最高，表明保護酶活性上升可能是鹿蹄草對低溫脅迫的一種保護性應激反應，與作用底物活性增加有關；但隨著溫度的進一步降低，植物體內活性氧產生與清除之間的動態平衡被打破，活性氧導致膜脂過氧化，造成膜結構損壞，有害的過氧化產物MDA逐漸積累，造成SOD、POD等保護酶系統被破壞，活性下降。但CAT酶活性開始便隨著溫度的脅迫時間增加而活性降低，說明CAT酶與植物抗寒性呈現負相關，因為在低溫脅迫積累的過氧化氫對CAT酶活性起著重要作用。因此，在試驗中，CAT酶并非為植物抗寒性有關。但植物的受逆境脅迫石油SOD酶、POD酶CAT酶共同協同作用完成的，才能是自由基維持在某一較低水平老保護植物蹄本身。

在受低溫脅迫時，丙二醛含量呈現上升趨勢，但上升幅度保持已穩定水平。MDA作為膜脂過氧化最終產物，是反映細胞膜傷害程度的一個重要指標。試驗中，MDA含量出現先升高再降低趨勢，可能與在低溫脅迫過程中體內通過增加保護酶的活性，尤其是SOD酶和POD酶的活性，發揮保護作用，抑制低溫引起的O-2的積累，從而降低MDA含量；但隨著溫度進一步降低，酶促保護系統受到破壞，清除自由基的能力。細胞膜是與外界環境發生物質交換的主要通道，是細胞感受環境脅迫最敏感的部位[37]。質膜透性直接影響其離子滲漏率，鹿蹄草在低溫脅迫下的電解質滲漏率隨著低溫脅迫時間的增加而相對升高，但變化幅度相對穩定，單一以離子滲漏率說明作為鹿蹄草抗寒性性參考，說明鹿蹄草抗寒性良好。可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸調節滲透勢來緩解低溫脅迫成為主要的保護因素，三者呈現先上升后下降的趨勢，其中脯氨酸能促進蛋白質水合作用，溶解可溶性蛋白，使植物具有一定的抗性和保護作用。在逆境脅迫時，脯氨酸還能維持細胞結構、細胞運輸和調節滲透壓等，并且其積累指數與植物的抗逆相關[37]。植物體內的可溶性糖會產生一定的變化，隨著處理溫度的降低，植物體內的可溶性糖含量處于增加的趨勢，低溫鍛煉下，其含量與抗寒性成正相關[38]。同時，糖還是冰凍保護劑，可能對冰凍敏感的蛋白質具有保護作用[39]。

植物體內的抗逆境生理生化變化是一個復雜的多因素調節的過程。為了適應或抵抗極端低溫等環境脅迫的影響，鹿蹄草植物從多方面的生理反應或低溫適應方來對外界脅迫進行響應，從抗寒物質代謝到酶系統等方面，都有生理反應的共同規律和各自特有的生理抗寒特性；而且要通過抗氧化系統等多種途徑不斷清除體內由低溫脅迫產生的活性氧自由基，控制膜脂的過氧化水平，有效地保護細胞內膜系統結構不受傷害，進而保證植物體本身在低溫脅迫環境下各項生理活動的正常進行，以及抵抗外界不良環境脅迫引起的傷害，這些不同變化的共同結果可能強化了植物的生理功能特性，改善了植物的物質代謝，增強了植物的抗寒性和對逆境脅迫的響應能力。

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