青島地區結核分枝桿菌rpoB變異與耐藥相關性研究

蘇海濤 王軍 鄒悅

青島地區結核分枝桿菌rpoB變異與耐藥相關性研究

蘇海濤 王軍 鄒悅

目的 探討青島地區結核分枝桿菌的rpoB變異特征與利福平耐藥的關系。方法 應用聚合酶鏈反應(PCR)直接測序法對來自青島地區54株利福平耐藥的結核分枝桿菌和14株利福平敏感的結核分枝桿菌的rpoB基因片段進行分析。結果 14株利福平敏感菌株中均未發生rpoB變異，而54株利福平耐藥菌株中有46株發生了rpoB變異，變異率為85.19%（46/54）；rpoB變異在利福平敏感菌株和利福平耐藥菌株中的分布差異有統計學意義（χ2=33.072，P=0）；16株利福平低濃度耐藥菌株中有10株發生rpoB變異，而38株利福平高濃度耐藥菌株中有36株發生rpoB變異，rpoB變異在利福平低濃度耐藥菌株和利福平高濃度耐藥菌株中的分布差異有統計學意義（χ2=6.893，P=0.009）；30株單耐利福平菌株中有24株發生rpoB變異，而24株多耐藥菌株中有22株發生rpoB變異，rpoB變異在單耐利福平菌株和多耐藥菌株中的分布差異有統計學意義（χ2=5.022，P=0.025）。結論 rpoB的變異是青島地區結核分枝桿菌對利福平耐藥的主要機制，且可能與耐藥濃度及是否多耐藥相關。

結核分枝桿菌；rpoB；利福平；耐藥

利福平是抗結核化療方案中一個關鍵藥物，它在結核病化療中起著重要作用。但是，在我國結核菌對利福平的耐藥發生率呈上升局勢[1]。隨著分子生物學技術的發展，結核菌耐藥的機制在基因水平已經逐漸闡明。研究發現結核分枝桿菌耐利福平與利福平作用的靶分子RNA聚合酶β亞單位的編碼基因rpoB突變有關[2]。本研究應用PCR直接測序法檢測結核分枝桿菌耐多藥臨床分離株的rpoB基因，對青島地區利福平耐藥結核分枝桿菌中rpoB的變異與利福平耐藥之間的相關性進行了研究，為明確青島地區利福平耐藥的分子特征、幫助臨床篩查耐利福平菌株及制定區域性耐藥肺結核的標準化治療方案提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源和藥敏試驗 68株結核分枝桿菌臨床分離株均來源于青島市胸科醫院確診的繼發性肺結核患者，其中利福平敏感菌株14株，利福平耐藥菌株54株，根據《結核病診斷細菌學檢測標準化規程》進行分枝桿菌培養、抗酸染色、菌種鑒定，采用比例法按國際標準對分離的菌株進行利福平的藥敏試驗。利福平耐藥菌株中，低濃度耐藥菌株16例（藥物濃度為50μg/ml），高濃度耐藥菌株38例（藥物濃度為250μg/ml），利福平單耐藥菌株30例，多耐藥菌株（包含耐多藥）24例。

1.2 DNA制備與聚合酶鏈反應(PCR) 取100μl菌懸液加自制的裂解液[(50mmol/L NaOH、10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、1% Triton X-100、1%NP-40、0.5mmol/L EDTA(pH8.0)]200 μl，混勻，100℃煮沸 10 min,，12000r/min離心5min，離心半徑7.9cm，取上清液作模板。置-20℃保存備用。

1.3 PCR反應

1.3.1 實驗儀器 PCR反應擴增儀（加拿大 BBI公司）；3730測序列分析儀(美國 ABI公司)；SW-CJ-1D潔凈工作臺（江蘇蘇潔凈化設備廠）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；DYY-8型穩壓穩流電泳儀（上海琪特分析儀器有限公司）；YXJ-2離心機（湘儀離心機儀器有限公司）；H6-1微型電泳槽（上海精益有機玻璃制品儀器廠）；凝膠成像系統（Gene Genius公司）；移液器（范圍 100～1000ml，20～200ml，0.5～10ml）（加拿大 BBI公司）。

1.3.2 主要試劑 TaqDNA聚合酶、10×PCR緩沖液(without Mg2+：100 mM Tris-HCl pH 8.8 at 25℃；500 mmol/L KCl，0.8%(v/v)Nonidet )；MgCl2（25 mmol/L）、dNTP（10mmol/L）、Marker、6×DNA Loading Dye（生工生物工程上海有限公司）；PCR產物純化回收試劑盒（生工生物工程上海有限公司SK1141）；10×TAE（400mmol/L三羥基氨甲烷醋酸鹽Tris-acetate和10mmol/L乙二胺四乙酸二鈉EDTA，pH8.0）。

1.3.3 引物設計 在GeneBank中查到rpoB基因（888164）的全序列，根據rpoB基因序列設計PCR引物序列1對，由上海生工生物技術公司有限公司合成，序列如下(5'to3')：上游引物F AGGACGTGGAGGCGATCA，下游引物R AACGGGTTGACCCGCGCGTA，應用上述引物對rpoB基因進行擴增的片段長度為358bp，包含81bp核心區。

1.3.4 PCR反應體系及反應條件 采用50μl 體系，包括模板 1 μl、上下游引物各 1 μl、10mmol/LdNTP 1 μl、Taq緩沖液 5 μl、25mmol/L MgCl2 5 μl、5U/μl TaqDNA聚合酶 0.5 μl、水 36.3 μl；反應條件：95℃預變性 3min，94℃變性 30s，55～60℃退火 35s，72℃延伸 40～50s，72℃修復延伸5～8min，35個循環。

1.4 測序 PCR產物純化回收試劑盒（生工生物工程上海有限公司SK1141），測序。

1.5 統計學方法 采用SPSS13.0軟件進行數據統計，計數資料組間比較采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增結果 68株臨床分離株rpoB基因擴增后均得到長度為358 bp 的片段，擴增陽性率為100%（見圖1）。

圖1 PCR擴增rpoB基因片段

2.2 DNA測序結果 14株利福平敏感菌株中均未發生rpoB變異，而54株利福平耐藥株中有46株發生rpoB變異，基因變異率為 85.19%（46/54）；46 株中 22 株（47.83%）為 81bp核心區531位密碼子TCG-TTG變異，18株（39.13%）為81bp核心區526位密碼子CAC-TAC變異，4株（8.70%）為81bp核心區

516位密碼子GAC-GTC變異，2株（4.35%）為516位和526位密碼子雙點變異。16株利福平低濃度耐藥菌株中有10株發生了rpoB變異，變異率為62.50%（10/16），其中6株為81bp核心區

531位密碼子TCG-TTG變異，4株為81bp核心區526位密碼子CAC-TAC變異；38株利福平高濃度耐藥菌株中有36株發生了rpoB變異，變異率為94.74%（36/38），其中16株為81bp核心區531位密碼子TCG-TTG變異，14株為81bp核心區526位密碼子CAC-TAC變異，4例為81bp核心區516位密碼子GAC-GTC變異，2例為516位和526位密碼子雙點變異。30株單耐利福平菌株中有24株發生rpoB變異，變異率為80.00%（24/30），而24株多耐藥菌株中有22株發生rpoB變異，變異率為 91.67%（22/24）。

2.2.1 rpoB變異特征及其與利福平耐藥表型的關系 14株利福平敏感菌株中均未發生rpoB變異，而54株利福平耐藥株中有46株發生rpoB變異，rpoB變異在利福平敏感菌株和利福平耐藥菌株中的分布差異有統計學意義（P＜0.01，見表1）。

2.2.2 利福平耐藥程度與rpoB變異關系 16株利福平低濃度耐藥菌株中有10株發生rpoB變異，而38株利福平高濃度耐藥菌株中有36株發生rpoB變異，rpoB變異在利福平低耐藥菌株和利福平高耐藥菌株中的分布差異有統計學意義（P＜0.01，見表 2）。

表1 利福平耐藥表型與rpoB變異關系（株）

表2 利福平耐藥程度與rpoB變異關系（株）

2.2.3 利福平耐藥菌株是否多耐藥與rpoB變異關系 30株單耐利福平菌株中有24株發生rpoB變異，而24株多耐藥菌株中有22株發生rpoB變異，rpoB變異在單耐利福平菌株和多耐藥菌株中的分布差異有統計學意義（P＜0.05，見表3）。

表3 利福平耐藥菌株是否多耐藥與rpoB變異關系（株）

3 討論

rpoB基因全長3543個堿基，rpoB基因編碼合成核糖核酸的RNA的β亞單位。當81bp核心區發生突變，利福平不能與RNA聚合酶β亞基結合，導致細菌對利福平耐受，rpoB基因突變以531位、526位點突變最為常見[3]，且以上兩個位點的突變是引起高水平耐藥的主要原因。除上述兩位點外，511、516、518、522位點也有突變，相對531和526較少，且是引起低水平耐藥的原因。除突變引起耐藥外，細胞壁滲透性的改變導致藥物攝入量的減少也是導致耐藥的原因之一[4]。本研究對來自青島地區的54株對利福平耐藥結核分枝桿菌臨床分離株的分析表明，85.19%（46/54）的對利福平耐藥菌株存在rpoB的變異，而14株對利福平敏感的結核分枝桿菌臨床分離株中不存在rpoB的變異，本研究結果顯示rpoB的變異形式為點突變，尤其是81bp核心區531位、526位變異是青島地區結核分枝桿菌對利福平耐藥的主要機制。朱敏等[5]報道在耐利福平菌株中，rpoB基因突變率達88.9%，以526、531位點改變最常見。孫勇[6]報道在利福平耐藥菌株中，86.2%rpoB基因發生突變，突變主要集中在531、526、516 3個位點。周志紅等[7]報道岳陽地區53株利福平耐藥株中39株rpoB基因存在不同位點的變異，突變率為73.58%，突變位點包括531、526、522、516、513、511，最主要的突變位點集中在 531 和 526 位點。而國外報道[8]，對利福平耐藥結核分枝桿菌的rpoB基因突變的發生率為92.7%～97.6%。產生上述差異的原因除了時間、地域及入選樣本量不同外，還與不同抽樣方法導致的結果差異性有關。

對利福平高濃度耐藥菌株rpoB的變異率明顯高于對利福平低濃度耐藥菌株，提示rpoB的變異與高濃度耐藥的相關性更高。多耐藥菌株rpoB的變異率顯著高于單耐利福平菌株，提示rpoB變異的結核分枝桿菌分離株可能更容易獲得對其他抗結核藥的額外耐藥。還有對利福平耐藥結核分枝桿菌未發現rpoB的變異，其耐藥機制也可能是細胞膜通透性的改變，但也不能排除還存在利福平耐藥的其他機制，有待進一步研究。本研究樣本量較小，難以全面反映整個青島市的利福平耐藥結核分枝桿菌rpoB的變異特征，這些需要以后加大樣本量，進行深入的研究，以期獲得更加全面、精確的科學依據。

[1] 劉宇紅，姜廣路，趙立平，等．第四次全國結核病流行病學抽樣調查-結核分枝桿菌耐藥性分析與評價[J]．中華結核和呼吸雜志，2002，25(6)：224-227.

[2] Telenti A，Imboden P，Marchesi F，et al.Detection of rifampicin-resistance mutations in Mycobacterium tuberculosis[J].Lancet,1993,341(8846):647-650.

[3] 崔振玲，景奉香，胡忠義．基因芯片檢測結核分枝桿菌利福平和異煙肼耐藥性研究[J]．中華結核與呼吸雜志，2004，7(27)，439-441．

[4] 李洪敏，王巍，李素梅，等．三種結核分枝桿菌耐藥基因的檢測方法[J]．中國防癆雜志，2002，12(6)，317-319．

[5] 朱敏，范玉美，盛國平，等．浙江省耐藥結核分枝桿菌katG、rpoB、embB基因突變特點[J]．研究醫學研究雜志，2008，37(3)：26-29．

[6] 孫勇．北京地區結核分枝桿菌耐藥分子特點及結核分枝桿菌耐喹諾酮類藥物泵機制的初步研究[D]．北京市結核病胸部腫瘤研究所,2012.

[7] 周志紅，王華洪．rpoB基因突變與結核分枝桿菌利福平耐藥相關性研究[J]．實用預防醫學，2013，20(10):1189-1191.

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Objective To investigate the relationship between rifampicin-resistance and mutation in rpoB of the tuberculosis mycobacterium from Qingdao area. Method The rpoB gene of 68 mycobacterium tuberculosis strains(54 rifampicin-resistant strains, 14 rifampicin-susceptible strains) were analyzed by the polymerase chain reaction direct sequencing technique. Results 46 of 54 rifampicin-resistant strains had mutation in rpoB,The mutation proportion is 85.19%; there was no gene change in rpoB of 14 rifampicin-susceptible strains. The mutation proportion in rpoB of rifampicin-resistant strains was signifi cantly higher than that of rifampicin-susceptible strains（χ2=33.072,P=0）; 10 of 16 low-level rifampicinresistant strains had mutation in rpoB, 36 of 38 high-level rifampicin-resistant strains had mutation in rpoB, The high-level rifampicin-resistant strains had a higher frequency of rpoB mutations than low-level rifampicin-resistant strains（χ2=6.893,P=0.009）; 24 of 30 single rifampicinresistant strains had mutation in rpoB, 22 of 24 multi-drug resistance tuberculosis strains had mutation in rpoB; The multi-drug resistance tuberculosis strains had a higher frequency of rpoB mutations than single rifampicin-resistant strains（χ2=5.022,P=0.025）. Conclusion The investigation indicated that rpoB mutation is the major molecular to generate the rifampicin-resistance in Qingdao area, may be associated with the concentration of bacterial drug resistance and multidrug resistance.

Tuberculosis mycobacterium; rpoB; Rifampicin; Drug resistance

10.3969/j.issn.1009-4393.2014.10.004

山東省青島市科技發展計劃項目 (09-1-1-27-nsh)

山東 266043 青島市胸科醫院 (蘇海濤 王軍 鄒悅)

蘇海濤 E-mail：sht152@163.com