真武湯對單側輸尿管梗阻模型大鼠整合素連接激酶和血管緊張素Ⅱ的干預研究

周波宋立群，贠捷，張丹萍，宋業旭，馬艷春，陳方明

（1.四川達州市中西醫結合醫院腎內科，635002；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院；3.黑龍江省中醫藥大學；4.四川省達州市畜禽繁育改良站）

真武湯對單側輸尿管梗阻模型大鼠整合素連接激酶和血管緊張素Ⅱ的干預研究

周波1宋立群2，贠捷3，張丹萍4，宋業旭3，馬艷春3，陳方明1

（1.四川達州市中西醫結合醫院腎內科，635002；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院；3.黑龍江省中醫藥大學；4.四川省達州市畜禽繁育改良站）

目的研究整合素連接激酶（ILK）和血管緊張素Ⅱ（Ang-Ⅱ）在UUO大鼠模型的表達及真武湯對腎間質纖維化（RIF）的干預作用。方法采用單側輸尿管梗阻（UUO）方法復制大鼠腎間質纖維化模型，隨機分為假手術組和造模組，造模組分為模型組、真武湯低劑量組、中劑量組、高劑量組和尿毒清對照組五組；分別給予相應藥物灌服，術后2、3和4周分批取材，收集其尿液、血清，生化法檢測24 h尿蛋白定量，ELISA法檢測ILK和Ang-Ⅱ的蛋白表達。結果真武湯能夠降低UUO大鼠模型血清中ILK和Ang-Ⅱ蛋白含量，具有統計學意義，真武湯中劑量組ILK和Ang-Ⅱ的含量蛋白最低。結論真武湯抑制了UUO大鼠模型血清中Ang-Ⅱ和ILK蛋白的表達，減緩了腎間質纖維化的發展和進程。

輸尿管梗阻；醫學，中國傳統；纖維化；血管緊張素Ⅱ；絲氨酸蛋白酶類；大鼠，Wistar

腎間質纖維化（RIF）幾乎是各種腎臟疾病進展到終末期的共同途徑和主要病理基礎，可由多種原因引起的細胞外基質（ECM）在腎間質內過度沉積和間質成纖維細胞的增生而形成［1］。整合素連接激酶（ILK）是一種新發現的進化保守的黏附蛋白，屬于一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，可與整合素β的胞質區相互作用，在不同類型的細胞中介導整合素信號傳導，與RIF的發生關系密切［2-4］，血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素血管緊張素系統（RAS）主要的生物活性肽，目前研究表明，AngⅡ在RIF的發生發展中發揮了多種病理生理作用［5-7］。本文應用酶聯免疫法研究單側輸尿管梗阻（UUO）大鼠模型RIF的動態變化過程中ILK和AngⅡ的動態變化以及真武湯的干預作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與藥物 SPF級健康雄性Wistar大鼠150只，由黑龍江省中醫藥大學動物實驗中心提供，體質量180～200g。真武湯飲片由黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院飲片室提供；尿毒清顆粒：廣州康臣藥業有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 尿蛋白測定試劑：南京建成生物工程研究所；ILK、AngⅡELISA試劑盒：武漢博德生物工程有限公司進口分裝。日立7170A型自動分析儀：日本日立公司；全自動定量酶標儀：奧地利；移液器：法國吉爾森公司；電熱恒溫箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 UUO大鼠模型的制備 大鼠適應性飼養1周，模型制備前1天禁食，自由飲水，用10%水合氯醛腹腔麻醉后，常規備皮、消毒、鋪巾，取左側肋腰點周圍為手術切口，逐層切開皮膚、肌肉及腹壁各層，暴露左側腎臟及腎蒂，分離左側輸尿管。假手術組僅切開腹腔并游離左側輸尿管，不做輸尿管結扎，其他各組大鼠用4-0絲線結扎，局部給予適量青霉素，逐層縫合。

1.4 實驗分組 將150只大鼠隨機分為假手術組和造模組，其中假手術組21只，造模組129只；造模組大鼠分為5組，即為模型組、真武湯低劑量組、真武湯中劑量組、真武湯高劑量組和尿毒清對照組，模型組21只，真武湯低、中、高劑量組各27只，尿毒清對照組27只。

1.5 給藥劑量及方法 真武湯組方和劑量參考《方劑學》（第五版）教材，低、中、高劑量組分別為7 g·kg-1·d-1、14 g·kg-1·d-1、28 g·kg-1·d-1，尿毒清顆粒：根據文獻劑量為3.75 g·kg-1·d-1。

從術后第1天開始給藥，每天灌服1次，假手術組和模型組給予等量的0.9%氯化鈉注射溶液，分別連續灌服2周、3周和4周。

1.6 標本收集及檢測 實驗分為給藥2周、3周和4周三個時間點進行研究，假手術組、模型組分別于給藥后第2周、3周和第4周末隨機各取材6只大鼠，真武湯低、中、高劑量組和尿毒清對照組分別取材8只大鼠，分別于取材前1天置代謝籠收集24 h尿液，采用日立7170A型自動分析儀檢測24 h尿蛋白定量，收集血清采用ELISA法于全自動定量酶標儀檢測ILK、AngⅡ的蛋白含量。

1.7 統計學處理 用SPSS 15.0進行數據處理，實驗數據采用±s表示，組間數據比較用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用LSD檢驗。

2 結果

2.1 真武湯對各組大鼠24 h尿蛋白定量的影響各組24 h尿蛋白定量差異無統計學意義，各組24 h尿蛋白定量結果差異無統計學意義，見表1。

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量結果（±s，mg／24h）

表1 各組大鼠24 h尿蛋白定量結果（±s，mg／24h）

注：各組比較，均P＞0.05

組別 鼠數（只） 2周 3周 4周假手術組6 15.76±1.40 16.13±1.59 15.65±1.35模型組 6 15.89±1.47 15.78±1.56 16.17±1.57真武湯低劑量組 8 16.02±1.52 15.96±1.49 16.05±1.59真武湯中劑量組 8 15.97±1.48 16.10±1.53 16.06±1.55真武湯高劑量組 8 16.07±1.56 15.83±1.42 15.96±1.47尿毒清對照組8 15.97±1.48 16.12±1.55 15.89±1.53

2.2 真武湯對各組大鼠ILK蛋白表達的影響 與假手術組比較，模型組各時間點ILK蛋白表達顯著增高，2周時最低，4周時最高，差異有統計學意義；與模型組比較，各藥物組ILK蛋白表達均低于模型組，差異有統計學意義，隨著時間的推移，降低的幅度逐漸減小；真武湯低、中、高劑量組比較，中劑量組ILK蛋白含量最低，見表2。

表2 各組大鼠血清中ILK蛋白表達的比較（±s，μg／L）

表2 各組大鼠血清中ILK蛋白表達的比較（±s，μg／L）

注：各時間點模型組與假手術組比較，aP＜0.05，cP＜0.01；各時間點藥物組與模型組比較，bP＜0.05，dP＜0.01；各時間點尿毒清對照組與真武湯中劑量組比較，均P＞0.05

2.3 真武湯對各組大鼠Ang-Ⅱ蛋白表達的影響與假手術組比較，模型組各時間點Ang-Ⅱ蛋白表達顯著增高，2周時最低，4周時最高，差異有統計學意義；與模型組比較，各藥物組Ang-Ⅱ蛋白表達均低于模型組，差異有統計學意義，隨著時間的推移，降低的幅度逐漸減小；真武湯低、中、高劑量組比較，中劑量組Ang-Ⅱ蛋白含量最低，見表3。

表3 各組大鼠血清中Ang-Ⅱ蛋白表達的比較（±s，μg／L）

表3 各組大鼠血清中Ang-Ⅱ蛋白表達的比較（±s，μg／L）

注：各時間點模型組與假手術組比較，aP＜0.05，cP＜0.01；各時間點藥物組與模型組比較，bP＜0.05，dP＜0.01，各時間點尿毒清對照組與真武湯中劑量組比較，均P＞0.05

3 討論

3.1 真武湯對24h尿蛋白定量的影響 UUO大鼠模型制備方法簡單，成功率高，病理改變表現較早，是一種研究RIF發生機制、腎臟細胞轉分化和評價RIF治療方法的理想模型［8］。各組大鼠24h尿蛋白定量差異無統計學意義，說明各組間尿蛋白的排泄率相當與UUO模型腎小球損傷一致性較少。

3.2 真武湯對各組大鼠ILK蛋白表達的影響 本研究結果顯示，模型組各時間點ILK蛋白表達較假手術組顯著增高。經過真武湯治療后，各藥物組ILK蛋白表達較模型組明顯降低。中劑量組ILK蛋白表達最低，說明真武湯可以降低UUO大鼠模型ILK的蛋白表達，中劑量組效果最佳。

3.3 真武湯對各組大鼠Ang-Ⅱ蛋白表達的影響

本研究結果顯示，模型組各時間點AngⅡ蛋白表達較假手術組顯著增高。經過真武湯治療后，各藥物組AngⅡ蛋白表達較模型組明顯降低。中劑量組AngⅡ蛋白表達最低，說明真武湯可以降低UUO大鼠模型AngⅡ的蛋白表達，中劑量組效果最佳。

ILK和AngⅡ作為RIF發生發展的信號通路，AngⅡ通過TGF-β1-Smad誘導EMT，促進TGF-β1等的合成和分泌，從而使TGF-β1-Smad信號轉導途徑的下游效應因子ILK表達［9-11］。本研究中，真武湯能夠同時降低ILK和AngⅡ的蛋白表達，從而發揮延緩腎小管損傷和RIF進程的作用，為臨床應用打下了基礎。

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Effect of Zhenwu decoction on integrin-linked kinase and angiotensinⅡin UUO rats

ZHOU Bo*，SONG Liqun，YUN Jie，ZHANG Danping，SONG Yeχu，MA Yanchun，CHEN Fangming
（*Department of Nephrology，Dazhou Integrated Traditional Chinese and Western Medicine Hospital，Dazhou 635002，China）

SONG Liqun，Email：qunli＠sina.com

ObjectiveTo research the effectof Zhenwu decoction on the expression of integrin linked kinase and angiotensin II，l and the renal interstitial fibrosis in UUO rats.MethodsThe ratmodel of renal interstitial fibrosis was successfully established by unilateral ureteral obstruction（UUO）.The ratswere divided into the control group and themodel group，and the Zhenwu decoction group（low dose，middle dose，high dose）and Niao Du Qing granules control group.The corresponding drug were administrated，and the urine and serum were collected after 2，3and 4 weeks.The level of24 hours urinary protein were tested by biochemical testing and the expression of integrin-linked kinase and angiotensionⅡwere determined by ELASA.ResultsZhenwu decoction could significantly reduce the expression of ILK and Ang-II in UUO ratmodel，and the lowest level of ILK and Ang-IIwere observed in themiddle dose group.ConclusionZhenwu decoction can inhibite the expression of Ang-Ⅱand ILK in the UUO ratsmodel，and slow the progress of renal interstitial fibrosis.

Ureteral obstruction；Medicine，Chinese traditional；Fibrosis；Angiotensin II；Serine proteases；Rats，Wistar

2014-03-20）

周波，醫師，Email：13398332775＠163.com

宋立群，主任醫師，教授，Email：qunli＠sina.com

R693.2

A

10.3969／J.issn.1672-6790.2014.03.022