蒼耳子提取物對斑馬魚的發(fā)育及運動行為的毒性研究

陳錫強，侯海榮，劉可春，王希敏，彭維兵，韓利文，王雪，陳維云

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014）

蒼耳子提取物對斑馬魚的發(fā)育及運動行為的毒性研究

陳錫強，侯海榮，劉可春*，王希敏，彭維兵，韓利文，王雪，陳維云

（山東省科學(xué)院生物研究所，山東省生物傳感器重點實驗室，山東 濟南 250014）

為研究蒼耳子提取物對斑馬魚胚胎發(fā)育及運動行為的影響，取受精后12／24 h斑馬魚胚胎，將胚胎分別置于不同濃度蒼耳子提取物溶液中，在作用不同時間后，顯微鏡下統(tǒng)計孵化率、死亡率和心率；取受精后120 h斑馬魚胚胎，用不同濃度蒼耳子提取物處理60 min后，利用行為學(xué)分析系統(tǒng)統(tǒng)計各組斑馬魚在0～10、10～20、20～30 min內(nèi)行為軌跡，基于游行距離與游行時間得到游行速度，并統(tǒng)計轉(zhuǎn)圈值。結(jié)果表明，蒼耳子提取物對受精后12 h斑馬魚胚胎的發(fā)育有毒性，使斑馬魚胚胎的孵化率降低，在提取物濃度大于15μg／mL時，孵化率低于40%；0.93μg／mL蒼耳子提取物可提高24 h斑馬魚胚胎的心率（P≤0.01），當提取物濃度大于7.5μg／mL時，心率顯著性降低（P≤0.01）；在行為學(xué)分析中發(fā)現(xiàn)，當蒼耳子提取物濃度大于3μg／mL時，游行速度與轉(zhuǎn)圈均值明顯增加。研究認為，蒼耳子提取物對斑馬魚胚胎發(fā)育有毒性作用，能夠興奮斑馬魚胚胎心率并增加其游行速度。

蒼耳子；斑馬魚；發(fā)育；運動行為；毒性研究

Key words：Fructus Xanthii；zebrafish；grow th；motion behavior；toxicity

蒼耳子為菊科植物蒼耳（Xanthium sibiricumPatr.）的干燥成熟帶總苞的果實，是臨床常用中藥材，多用于鼻病、過敏性疾病等的治療。蒼耳子臨床應(yīng)用歷史悠久，其毒副作用也早有記載，《品匯精要》載蒼耳子“味苦甘，性溫，有小毒”。有文獻報道患者誤食蒼耳子后發(fā)生中毒，引起神經(jīng)毒性反應(yīng)、肝腎損害和繼發(fā)性腦水腫［1－2］。近年在蒼耳子肝毒性作用機制、動脈平滑肌的損傷等方面都有新發(fā)現(xiàn)［3－4］，蒼耳子毒性成分測定、炮制減毒方法［5］也取得了新的進展。本文研究了蒼耳子水提取物對斑馬魚胚胎的發(fā)育及運動行為的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及其配制

蒼耳子水提取物樣品由四川省中醫(yī)藥研究院提供，其水溶性好，復(fù)溶后過濾，儲液濃度為10 mg／m L，4℃保存?zhèn)溆谩Ｃ撃殒溍沟鞍酌福徸员本┧魅R寶公司。三卡因購自Sigma公司，蒸餾水配制為1 mg／mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗動物

實驗用斑馬魚為AB系斑馬魚，魚種取自山東省科學(xué)院斑馬魚藥物篩選平臺。斑馬魚的養(yǎng)殖和繁殖參照Westerfield法［6］。

1.3 發(fā)育毒性實驗

取健康成熟的斑馬魚雌雄交配繁殖獲得受精卵，純凈水沖洗3次后，再將受精卵移入胚胎培養(yǎng)用水中，28℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)發(fā)育。取受精后12 h胚胎隨機分組，每組20只，設(shè)蒼耳子提取物4.7、6.3、8.4、11.25、15、20μg／m L共6個濃度組和空白對照組，光照培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)至48 h，計算各組孵化率；取受精后24 h胚胎隨機分組，每組20只，設(shè)蒼耳子提取物0.93、1.85、3.75、7.5、15、30μg／m L濃度組和空白對照組，光照培養(yǎng)箱28℃培養(yǎng)至60 h后，用三卡因1 mg／mL實施麻醉后在XSJ2D型（Olympus公司）倒置顯微鏡下統(tǒng)計心率和死亡率。

1.4 行為學(xué)實驗

根據(jù)斑馬魚行為學(xué)預(yù)實驗結(jié)果，設(shè)定蒼耳子提取物1.85、3.75、7.5、15、30μg／mL濃度組和空白對照組，24孔板每孔一只120 hpf胚胎，每個實驗組6個胚胎，將24孔板放入培養(yǎng)箱孵育1 h，然后將24孔板放入斑馬魚行為學(xué)分析系統(tǒng)的暗箱中，使用zeblab軟件分別采集10、20、30 min內(nèi)各組總游行距離、游行時間和轉(zhuǎn)圈值，其中游行速度由總距離／游行時間得到，各數(shù)值分別計入統(tǒng)計。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件SPSS對實驗數(shù)據(jù)求均值，并進行樣本組間多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 多濃度蒼耳子水提取物對斑馬魚的發(fā)育毒性

蒼耳子水提取物對12 h卵膜內(nèi)斑馬魚的發(fā)育有毒性反應(yīng)，隨著濃度增加，斑馬魚胚胎的孵化率降低，大于15μg／m L時孵化率低于40%（圖1）；發(fā)育24 h的斑馬魚胚胎死亡率隨著濃度的增加逐漸增加，在15μg／m L時，死亡率增加明顯，高濃度組出現(xiàn)心臟積液，翹尾等畸形（圖2～3）。實驗結(jié)果顯示，0.93μg／mL低濃度蒼耳子提取物可顯著性地提高心率，當濃度大于7.5μg／mL時心率出現(xiàn)顯著性降低（圖4）。

2.2 多濃度蒼耳子水提取物對斑馬魚運動行為的影響

在30 min行為軌跡分析中，3.75μg／mL以上濃度藥物組與對照組比較隨著濃度的增加，斑馬魚胚胎游行速度明顯提高；轉(zhuǎn)圈均值也顯著增加（圖5～6），在濃度大于3.75μg／m L時尤為明顯，30μg／m L濃度組在30 min內(nèi)轉(zhuǎn)圈均值出現(xiàn)明顯下降趨勢（圖7）。

圖1 蒼耳子水提取物對斑馬魚胚胎孵化率的影響Fig.1 Impact of FX extract on hatch rate of zebrafish embryos

圖2 蒼耳子水提取物對斑馬魚胚胎死亡率的影響Fig.2 Impact of FX extract on mortality rate of zebrafish embryos

圖3 蒼耳子水提取物對斑馬魚胚胎發(fā)育影響Fig.3 Impact of FX extract on the growth of zebrafish embryos

圖4 蒼耳子水提取物對斑馬魚胚胎心率的影響Fig.4 Impact of FX extract on heart rate of zebrafish embryos

圖5 蒼耳子水提取物對斑馬魚游泳速度的影響Fig.5 Impact of FX extract on swimming speed of zebrafish embryos

圖6 蒼耳子水提取物對斑馬魚轉(zhuǎn)圈值的影響Fig.6 Impact of FX extract on rotation value of zebrafish embryos

圖7 蒼耳子水提取物對斑馬魚行為軌跡的影響Fig.7 Impact of FX extract on behavior track of zebrafish embryos

3 討論

由于中藥材多以復(fù)方應(yīng)用于臨床，使得其毒副作用在長期的臨床應(yīng)用中往往被忽視。近年來隨著對中藥材研究的逐步深入，關(guān)于中藥材及中成藥毒副作用的報道逐漸增多，增進了對中藥材的毒副作用的認識，毒性研究促使其應(yīng)用更加的安全規(guī)范，對于拓展中藥材尤其有毒中藥的應(yīng)用有深遠的意義。

斑馬魚作為一種新型模式動物，具有許多與眾不同的特點，例如產(chǎn)卵量多、繁殖周期快且易于飼養(yǎng)，前期胚胎整體透明［7－8］，斑馬魚的基因圖譜基本清晰且與人類相似。因此，斑馬魚在行為學(xué)中的應(yīng)用前景逐漸被研究者所認識［9－11］。行為學(xué)檢測是一種比較經(jīng)濟、便捷和有效的方法，在相應(yīng)軟件的幫助下，行為學(xué)實驗不僅變得簡單快捷，而且可以定量或是高通量地研究成癮性、學(xué)習(xí)、失眠以及焦慮抑郁等行為學(xué)改變。

有報道指出蒼耳子中的蒼術(shù)苷（atractyloside）與羧基蒼術(shù)苷（carboxyatractyloside）是主要的毒性成分，也是活性成分，已發(fā)現(xiàn)其包括急性與亞急性毒性、肝腎損害、細胞毒性等毒性反應(yīng)［12－13］，但對于神經(jīng)系統(tǒng)的作用尚未見報道。本實驗研究了蒼耳子提取物對斑馬魚的毒性作用，發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加和斑馬魚胚胎出現(xiàn)孵化率降低、死亡率增加、心臟畸形等毒性體征，提示蒼耳子對于斑馬魚發(fā)育及循環(huán)系統(tǒng)發(fā)育有明顯毒性。在行為學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，蒼耳子提取物具有興奮作用，隨著濃度增加，游行速度、轉(zhuǎn)圈值均明顯增加；隨著時間延長，速度出現(xiàn)下降趨勢，但仍高于對照組。提示蒼耳子提取物對神經(jīng)系統(tǒng)有一定興奮作用，這種作用是單純神經(jīng)毒性或者是整體毒性的反應(yīng)還需要更深入的實驗研究。斑馬魚行為分析可以減為中藥神經(jīng)系統(tǒng)毒性研究的快捷研究手段，有利于中藥新毒性的發(fā)現(xiàn)，對于全面地了解有毒中藥的副作用大有益處。

［1］閻芳華.過量服用蒼耳子中毒致死一例［J］.山西醫(yī)藥雜志，2007，36（3）：212.

［2］趙勝乾，吳敏.蒼耳子中毒致急性腎功能衰竭及肝損傷1例［J］.實用診斷與治療雜志，2004，18（6）：514.

［3］WANG Y，HAN T，XUE L M，et al.Hepatotoxicity of kaurene glycosides from Xanthium strumarium L.fruits in mice［J］. Pharmazie，2011，66（6）：445－449.

［4］SONG R，BIAN H N，HUANG X L，et al.Atractyloside induces low contractile reaction of arteriolar smooth muscle through mitochondrial damage［J］.Journal of Applied Toxicology，2012，32（6）：402－408.

［5］CHEN L Y，HU A，CHANG C J.The degradation mechanism of toxic atractyloside in herbal medicines by decoction［J］. Molecules，2013.18（2）：2018－2028.

［6］WESTERFIELD M，WEGNER J，JEGALIAN B G，et al.Specific activation of mammalian Hox promoters in mosaic transgenic zebrafish［J］.Genes Dev，1992 6（4）：591－598.

［7］孫智慧，賈順姬，孟安明.斑馬魚：在生命科學(xué)中暢游［J］.生命科學(xué)，2006，18（5）：431－436.

［8］王思鋒，劉可春，韓利文，等.抗血管生成藥物篩選及其新模型——斑馬魚［J］.山東科學(xué)，2007，20（4）：12－15.

［9］劉昌盛，穆宇，杜久林，等.斑馬魚在生命科學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.生命科學(xué)，2007，19（4）：382－386.

［10］王躍祥，鐘濤，宋后燕，等.斑馬魚發(fā)育遺傳學(xué)研究進展［J］.國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2004，27（4）：220－223.

［11］戚飛，林碩，樊啟昶，等.斑馬魚反轉(zhuǎn)錄病毒插入突變技術(shù)的發(fā)展及其在基因飽和突變與篩選中的應(yīng)用［J］.遺傳學(xué)報，2004，31（7）：750－757.

［12］PEBAY-PEYROULAE，DAHOUT-Gonzaliez C，KAHN R，et al.Structure of mitochondrial ADP／ATP carrier in complex with carboxyatractyloside［J］.Nature，2003，426（6962）：39－44.

［13］OBATOMID K，THANH N T，BRANT S，et al.The toxic mechanismandmetabolic effects of atractyloside inprecision-cut pig kidney andliver slices［J］.Arch Toxicol，1998，72（8）：524－530.

Toxicity of Fructus Xanthii extract to the growth and motion behavior of zebrafish embryos

CHEN Xi-qiang，HOU Hai-rong，LIU Ke-chun*，WANG Xi-min，PENG Wei-bing，HAN Li-wen，WANG Xue，CHEN Wei-yun
（Shandong Provincial Key Labo ratory of Biosensors，Biology Institu te，Shandong Academy of Sciences，Jinan 250014，China）

We put 12／24h zeb rafish emb ryos after fertilization into the solution of different concentrations Fruc tus Xanthii（FX）to investigate the toxicity of FX extract to the grow th andmotion behavior of zebrafish embryos．We then calculate their hatch rate，mortality rate，and heart rate under a mic roscope after different time．We treat120 h zeb rafish embry of or 60 minutes with different concentrations FX extrac t，and then recordtheir behavior track within 0～10 m，10～20 m，and 20～30 mw ith ethology analysis system．We also get sw imming speedbasedon their sw imming distance andtime andtheir rotation value．Results show that FX extrac t has toxicity to 12 h zeb rafish emb ryos after fertilization，which decrease their hatch rate．The hatch rate is below 40%when the extrac t concentration is greater than 15μg／mL．FX extract of 0．93μg／mL can inc rease the heart rate of 24 h zeb rafish emb ryos（P≤0．01）．We discover that sw imming speedandrotation value all significantly increase when the extract concentration is greater than 3μg／mL through ethology analysis．Our conclusion is that FX extrac thas toxicity to zeb rafish embryos and can inc rease their heart rate ands wimming speed．

R965.1；R932；R944

A

1002-4026（2014）05-0009-05

10.3976／j.issn.1002－4026.2014.05.002

2014-06-20

國家自然科學(xué)基金（81202584）；山東省科技攻關(guān)項目（2011GHY11505）

陳錫強（1972－），男，博士，研究方向為藥理學(xué)。Email：cxqq＠sina.com

*通訊作者，劉可春，男，博士，研究方向為藥物篩選。Email：hliukch＠sdas.org