腹瀉癥候群致瀉性大腸埃希氏菌血清型及毒力基因檢測

慕毅敏 蔡旭明 周敬綱 蔡旭輝

致瀉性大腸埃希菌生存與人和動物的腸道中，隨糞便排出而污染水源、土壤、食品、器具等，人群對致瀉大腸埃希菌普遍易感，根據其致病機制，致瀉大腸埃希菌至少可分為5個類型：腸產毒素大腸埃希菌（ETEC）、腸致病性大腸埃希菌（EPEC）、腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）、腸出血性大腸埃希菌（EHEC）、腸集聚性黏附性大腸埃希菌（EAEC）。其中，ETEC是發展中國家嬰幼兒及旅游者腹瀉的主要病原，EPEC是嬰兒腹瀉的主要病原，EIEC主要引起較大兒童和成人腹瀉[1-2]。為了全面了解本地區腹瀉癥候群中致瀉大腸埃希菌的感染情況，查清致瀉大腸埃希菌的血清群、型分布規律以及所攜帶毒力基因[3-6]，為腹瀉病的防治對策提供科學依據[7-8]，現將2012-2013年本地區腹瀉癥候群中致瀉大腸埃希菌的監測檢驗情況報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 本地區2012-2013年腹瀉癥候群監測醫院門診未使用過抗生素腹瀉患者的稀便、水樣便、黏膿便或膿血便等。標本總計719份，其中7歲以下嬰幼兒618份，7歲以上兒童及成人101份。

1.2 標本的分離程序

1.2.1 分離 用無菌拭子采集少量糞便直接接種麥康凱（MAC）瓊脂平板和O157顯色平板上，溫度（36±1）℃，培養18~24 h。

1.2.2 增菌 用無菌拭子采集少量糞便接種mEC肉湯增菌液，（36±1）℃，培養6 h后，取1 mL用O157免疫磁珠進行富集后，接種于O157顯色平板和MAC平板18~24 h。

1.2.3 挑取可疑菌落 挑取MAC瓊脂平板上發酵乳糖的桃紅色、不透明的可疑菌落或O157顯色平板上紫紅色或淡紫色、中等大小菌落進行生化初篩實驗。

1.2.4 生化初篩 凡是TSI斜面產酸或不產酸、底層產酸、不產生H2S的菌株，進行IMViC實驗，結果為++--或-+--，尿素-。

1.2.5 多重PCR 通過對主要致瀉大腸埃希菌目的基因多重PCR擴增片段，判斷擴增陽性結果。

1.2.6 血清型鑒定 挑取經PCR試驗證實為致瀉性大腸埃希菌的純培養物，用相應致瀉大腸O多價、O單價、K、H診斷血清進行血清玻片凝集試驗。

1.2.7 結果判定 綜合生化試驗、多重PCR試驗和血清型分型試驗進行鑒定和報告。

2 結果

2.1 一般情況 本次檢測分離到血清凝集致瀉大腸埃希菌65株，占所檢標本總數的9.04%（65/719），其中7歲以下嬰幼兒59株，7歲以上兒童及成人6株；而未分血清型致瀉大腸埃希菌27株，占檢測標本的3.75%（27/719），其中7歲以下嬰幼兒24株，7歲以上兒童及成人3株；其中EPEC檢出率為10.15%（73/719），毒力基因檢測以escV為主，占8.90%（64/719）。

2.2 65株血清凝集致瀉性大腸埃希菌的血清分型 分離出的EPEC、EIEC、ETEC共分8種O血清型，其中EPEC分為6種不同血清型，主要血清型為O55：H59、O128：H67；EIEC和ETEC各分一種血清型，見表1。

表1 65株血清凝集致瀉性大腸埃希菌血清分型分布結果

2.3 65株血清分型凝集菌株毒力基因的分布情況 65株血清分型凝集菌株中，49株（75.38%）攜帶escV，5株（7.69%）攜帶escV+bfpB，7株（10.77%）攜帶invE，4株（6.16%）攜帶elt，見表2。

2.4 27株未分血清型致瀉性大腸埃希菌毒力基因分布結果 檢測出毒力基因共5種，分別為escV、escV+bfpB、invE、elt、astA，分屬EPEC、EIEC、ETEC、EAEC，見表3。

3 討論

大腸埃希菌感染全年均可發病，但大多發生于5-10月，其中7-9月是發病高峰。致瀉性大腸埃希菌生存于人和動物的腸道中，人群普遍易感，引起急性胃炎、急性菌痢、出血性腸炎，傳播因素多種多樣，包括水、食品、日常生活用品、蒼蠅等，還可以通過接觸動物或帶菌者傳播[1]。

本次檢測分離到血清凝集致瀉大腸埃希菌65株，占所檢標本總數的9.04%（65/719），而未分血清型致瀉大腸埃希菌27株，占檢測標本的3.75%（27/719）；其中EPEC檢出率為10.15%（73/719），與國內相關報道基本符合[2-3]，毒力基因檢測以escV為主，占8.90%（64/719）；其余毒力基因escV+bfpB、invE、elt、astA與相關報道基本一致[4-5]。

在大多數實驗室，致瀉性大腸埃希菌（DEC）常規測定只能鑒定DEC的表型特征，然而，這些方法在鑒定5種具體的DEC是不夠的[9-11]。長期以來，對于腹瀉患者的細菌學檢測主要是分離糞便標本中的腹瀉病原菌，然而，由于大多數患者發病后很快使用抗生素，而使細菌的分離培養結果不理想。因此，傳統的糞便細菌學檢驗方法已不能滿足診斷的要求，在我國大多數微生物實驗室，如果從腸道分離的菌株不與ETEC、EPEC、EIEC、EHEC、EAEC這5種大腸埃希菌的診斷血清發生凝集，就判斷為腸道正常大腸埃希菌。這樣做往往會失掉大部分病原菌的檢出率[12-15]。近年來，多重PCR作為一種不依賴于細菌培養，適合于在細菌種群多樣性體系中快速篩查疑似病原菌的新技術而廣泛應用，此方法檢測毒力基因更快速，敏感性高，特異性強[16-20]。

表2 65株血清分型菌株毒力基因分布

表3 27株未分血清型致瀉性大腸埃希菌毒力基因分布 株（%）

因此，在腹瀉患者的大腸埃希菌檢測中，在傳統的細菌分離培養、生化試驗、血清學鑒定的基礎上，有必要進行大腸埃希菌的毒力基因檢測，以提高陽性檢出率，避免漏檢，提高致瀉性大腸埃希菌的診斷。

[1]倪宏.42例小兒腹瀉的臨床研究[J].中國醫學創新，2012，9（8）：121.

[2]龔可勝.消旋卡多曲治療48例成人急性腹瀉患者的療效觀察[J].中國醫學創新，2012，9（8）：44-45.

[3]張英.消旋卡多曲治療秋季腹瀉的臨床研究[J].中國醫學創新，2012，9（22）：28-29.

[4]張蔚起，張德雄，林東龍.小兒輕中度腹瀉引發驚厥72例臨床分析[J].中國醫學創新，2012，9（16）：108-109.

[5]周永明.應用灰色模型預測其他感染性腹瀉和病毒性肝炎的發病趨勢[J].中國醫學創新，2012，9（8）：159-160.

[6]時全，黃新明，李朝陽，等.致瀉大腸埃希菌感染在腹瀉病中地位的研究[J].中國衛生檢驗雜志，2005，15（1）：5-8

[7]吳開宇.EPEC，EIEC，EREC與嬰兒腹瀉關系的研究[J].腹瀉病專輯，1989，10（1）：195-196.

[8]任春陽.EPEC相關毒力基因與腹瀉的相關性[D].溫州醫學院，2007.

[9]徐義剛，崔麗春，李蘇龍，等.多重PCR-DHPLC檢測4種主要致瀉性大腸埃希菌方法的建立于應用[J].食品科學，2010，31（20）：293-297.

[10]孔海深.致瀉大腸埃希菌的分子分型和流行病學研究[D].浙江大學，2011.

[11]葉菊蓮，占利，程蘇云，等.嬰幼兒腹瀉致瀉大腸埃希菌PCR毒力基因檢測[J].中國衛生檢驗雜志，2009，19（9）：2055-2057.

[12]張菊玲，崔恩博.致瀉大腸埃希菌的分布及耐藥性研究[J].傳染病信息，2012，25（3）：180-182.

[13]黃芳，鄧瑛，曲梅，等.2010年北京市感染性腹瀉病原學監測分析[J].中華預防醫學雜志，2011，45（9）：820-824.

[14]齊小秋.病原生物學檢驗[M].衛生部病原生物學檢驗教材編寫組，2009：305-319.

[15]楊黨鵬，李蘇利.腹瀉病原菌的細菌培養及鑒定[J].人民軍醫，2001，44（2）：115-117.

[16]Brandal L T，Lindstetd B A，Lena A，et al.Octaplex PCR and fluorescence-based capillary electrophoresis for identification of human diarrheagenic Escherichia coil and Shigella ssp[J].J Microbial Methods，2007，68（5）：331-342.

[17]黃新蓉，劉劼，葉長蕓.應用16SrDNA克隆文庫篩查腹瀉病爆發病原體及特異毒力基因驗證[J].中國人獸共患病學報，2010，26（10）：900-903.

[18]Stacy-Phipps S，Mecca J J，Weiss J B.Multiplex PCR assay and simple preparation method for stool specimens detect enterotoxigenic Escherichia coli DNA during course of infection[J].J Clin Microbial，1995，33（5）：1054-1059.

[19]Rappelli P，Madddau G，Mannu F，et al，Development of a set of multiplex PCR assays for the simultaneous identification of enterotoxigenic，enteropathogenic，enterohemorrhagic and enteroinvasive Escherichia coli[J].New Microbial，2001，24（1）：77-83.

[20]Vidal R，Vidal M，Lagos R，et al.Multiplex PCR for Diagnosis of Enteric Infections associated with Diarrheagenic Escherichia coli[J].Journal of Clinical Microbiology，2004，42（4）：1787-1789.