豬口蹄疫O型緬甸98系毒株對乳鼠的適應性研究

王莉君 劉 宏

(1.新疆農業大學動物醫學學院,新疆烏魯木齊 830000；2.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

豬口蹄疫O型緬甸98系毒株對乳鼠的適應性研究

王莉君1劉 宏2

(1.新疆農業大學動物醫學學院,新疆烏魯木齊 830000；2.新疆天康畜牧生物技術股份有限公司,新疆烏魯木齊 830000)

口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒引起的豬、牛、羊等偶蹄動物的一種烈性傳染病，給流行國家和地區帶來嚴重的經濟損失，篩選與田間流行毒株基因型相近的、免疫原性良好的、適合生產特性的制造疫苗毒株，將對疫情的有效控制會起到非常重要的作用。

本論文針對中國農業科學院國家口蹄疫參考實驗室分離鑒定的四株東南亞拓撲型緬甸98系O型口蹄疫乳鼠毒，在乳鼠上進行傳代，對各毒株的收毒時間和最終代次的毒價進行比較，并根據結果選擇對乳鼠適應性最好的一株，作為檢驗用毒株，并為生產用毒株的選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

四株東南亞拓撲型緬甸98系O型口蹄疫乳鼠毒，分別為O/ GD/10-8株、O/GD/10-9株、O/GX/10-10株、O/XJ/10-11株；2～3日齡昆明系乳鼠帶母鼠飼養；磷酸鹽緩沖溶液（PBS）；50%甘油-磷酸鹽緩沖液；石英砂購自天津盛奧精細化工公司；高速低溫離心機；冷藏冷凍兩用冰箱；眼科手術剪、鑷；注射器；移液器；陶瓷研缽。

1.2 方法

1.2.1 磨毒傳代

分別將四支O型口蹄疫乳鼠毒稱重，取約1g加入滅菌后的研缽，再加入適量滅菌石英砂充分研磨，期間加入適量PBS，使之完全研磨成勻漿，最終制成1：10的組織懸液，放在2～8℃的冰箱中，浸毒16～20h。浸毒結束后，使用低溫離心機，在4℃左右以3000r/min離心20mn，吸取上清液，于頸背部皮下接種2～3日齡的乳鼠8～12只，每只乳鼠的注射量為0.1ml。接種后觀察，并收取發病典型的瀕死乳鼠或死亡乳鼠，將乳鼠用1：50新潔爾滅清洗兩遍，再用PBS清洗兩遍后，剪去頭、四肢、尾，剪開胸腔和腹腔，剔除內臟，剝去皮和皮下脂肪，用50%甘油-磷酸鹽緩沖液保存。此胴體即為第一代乳鼠毒（MF1）。按上述方法，繼續稱重、研磨，即可進行下一代乳鼠毒的傳代工作。

1.2.2 LD50測定

將所取毒樣混合均勻，抽取毒樣0.2ml，沿管壁緩慢注入盛有1.8ml稀釋液的離心管中。加樣時吸頭尖不得接觸稀釋液液面，并重復吹兩次，盡量減少吸頭內壁殘留液體，然后將管內液體混勻，更換吸頭準備進行下一步稀釋。以此方法作10倍系列稀釋，期間每個滴度換一支吸頭，取10-5，10-6，10-7，10-8等各稀釋度，每稀釋度頸背部皮下接種2～3日齡的乳鼠4～5只，每只注射0.2ml，各稀釋度分別作標記。將乳鼠置于23～26℃室溫環境下，帶母鼠飼養。每日觀察1～2次，記錄每次觀察時發病、死亡的乳鼠只數。于注射后24h之前死亡乳鼠不計數。連續觀察4～7日，根據發病死亡乳鼠數，按照Reed-Muench法計算LD50。

2 結果與分析

在乳鼠傳代過程中，四株毒的收毒時間和最終代次的LD50如下表所示：

由上表可知，毒價方面，四株毒種在傳至MF5代時，O/ GD/10-8株最高，O/GD/10-9株、O/XJ/10-11株次之，O/GX/10-10株相對略低。病毒收毒時間方面，O/GD/10-8株在MF3和MF4兩代中，發病、死亡時間出現反復，而且波動較大，在MF5代收毒時，發病后死亡時間拖延至9.5h（12.5h～22h收）；O/GD/10-9株同O/GD/10-8株相似，在MF3和MF4兩代中，發病、死亡時間出現反復，在MF5代收毒時，發病后死亡時間略有延長，拖延至7.5h（17h～24.5h收）；O/GX/10-10株也是在MF3和MF4兩代中，發病、死亡時間出現反復，但在MF5代收毒時，發病后死亡時間為4.5h（15h～19.5h收）；O/XJ/10-11株從MF1代至MF5代，發病、死亡時間一直呈逐步縮短的狀態，在MF5代收毒時，發病后死亡時間為2h（17.5h～19.5h收）。

綜合毒價高低和收毒時間長短，在對乳鼠的適應性方面，選擇了收毒時間相對穩定、毒價比較高的O/XJ/10-11株繼續進行了傳代，傳至MF7代時，收毒時間趨于穩定（15h～18h），測得LD50為10-8.0/0.2ml。

3 討論與結論

四株口蹄疫毒種在傳代過程中，能較快的適應乳鼠，并且乳鼠的發病、死亡時間基本呈現逐漸縮短、集中的趨勢，但在細節上略有區別。毒價方面，四株毒種MF5代的毒價差異不大，LD50均不低于10-7.5/0.2ml。綜合毒價和收毒時間兩方面因素考慮，在對乳鼠的適應性方面，選擇了收毒時間相對穩定、毒價比較高的O/XJ/10-11株繼續進行傳代，傳至MF7代，收毒時間趨于穩定（15h～18h），MF7代測得LD50為10-8.0/0.2ml。本研究結果顯示，四株待選毒株中，O/XJ/10-11株對乳鼠的適應性最好，致病性強，傳代過程穩定，收毒時間短，可作檢驗用毒株使用。

表2 -1 四株口蹄疫種毒鼠毒收毒時間和最終代次的LD50