磁性固定化青霉素酰化酶催化拆分（R，S）- 2-氯苯甘氨酸甲酯

薛 屏，谷耀華，張立根，馬 原，李 鵬

（寧夏大學 省部共建天然氣轉化國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川 750021）

精細化工

磁性固定化青霉素酰化酶催化拆分（R，S）- 2-氯苯甘氨酸甲酯

薛 屏，谷耀華，張立根，馬 原，李 鵬

（寧夏大學 省部共建天然氣轉化國家重點實驗室培育基地，寧夏 銀川 750021）

將青霉素酰化酶（PGA）固定于飽和磁化率為6.5 emu/g、富含環氧基的大孔磁性聚合物微球（GM）上，所得磁性固定化酶PGA/GM用于在水相中催化（R，S）-2-氯苯甘氨酸甲酯（2-CGM）發生不對稱水解反應；在20 ℃下反應48 h，所得（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的對映體過量值分別為98.0%和58.8%，底物總轉化率為62.5%。PGA經GM固定化后，催化（R，S）-2-CGM水解反應的活性和對映體選擇性均有顯著提高。PGA/GM具有較強的磁響應性，在外加磁場的作用下能進行快速分離和洗滌，機械損失小；經6次循環使用，其活性和對映體選擇性未出現大幅衰減。

磁性固定化青霉素酰化酶；（R，S）-2-氯苯甘氨酸甲酯；不對稱水解反應；酶催化拆分；對映選擇性

目前全世界開發研究的新藥中手性藥物占90%以上，非天然氨基酸是手性藥物合成的一類重要中間體［1-3］。（S）-2-氯苯甘氨酸是具有生物活性的非天然氨基酸，（S）-2-氯苯甘氨酸甲酯（2-CGM）是治療血栓性疾病新藥氯吡格雷的關鍵手性結構單元［4-5］。氯吡格雷S-構型的分子具有強的血小板凝聚抑制活性，其耐受性是R-構型的40倍，且R-構型用藥后會產生抽搐副作用［6-7］，因此氯吡格雷是以S-構型作為藥物進行銷售的。采用先合成氯吡格雷外消旋體，再利用（S）-樟腦磺酸進行對映體拆分的方法［8-9］，雖能得到（S）-氯吡格雷，但浪費了近50%的（R）-氯吡格雷。若以（S）-2-CGM直接合成（S）-氯吡格雷，既省去了手性試劑后拆分過程，又提高了原料的利用率和產品的質量［10-11］。而通過化學法利用（S）-酒石酸進行（R，S）-2-CGM的拆分［12-14］，需使用大量的手性試劑，過程繁瑣，生產效率低下。

脂肪酶催化拆分手性醇、酸及其衍生物已有許多研究報道［15-17］，且取得了很好的實驗結果。目前青霉素酰化酶（PGA）已能高效表達和大批量進行生產，對其催化作用的應用研究主要集中于催化水解青霉素G鹽制備6-氨基青霉烷酸和催化合成新型β-內酰胺類抗生素［18-19］，而用于動力學拆分手性對映體的研究較少。Fadnavis等［20］利用PGA對N-苯乙酰化氯苯甘氨酸進行催化水解，獲得了光學純（S）-氯苯甘氨酸。而利用PGA催化（R，S）-2-CGM發生不對稱水解反應，獲得（S）-2-CGM單一對映體的研究尚未見文獻報道。

本工作將PGA固定于富含環氧基的大孔磁性聚合物微球（GM）上，獲得磁性固定化酶PGA/ GM，研究了PGA/GM對（R，S）-2-CGM發生不對稱水解反應的催化作用。

1 實驗部分

1.1 酶與試劑

PGA：380 U/mL，浙江順風海德爾公司；假單胞菌脂肪酶（PSL）：30 U/mg，Amano公司；柱狀假絲酵母脂肪酶（CCL）：4.01 U/mg，Fluka公司；南極假絲酵母脂肪酶（CAL-B）：10.8 U/mg，Fluka公司；（R，S）-2-氯苯甘氨酸：化學純，武漢遠成共創科技有限公司；甲基丙烯酸縮水甘油酯：化學純，Fluka公司；N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺、偶氮二異丁腈：化學純，天津科密歐化學試劑開發中心；FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O：分析純，天津福晨化學試劑廠；Span 60、硬脂酸鈣、二氯亞砜：化學純，上海潤捷化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 Fe3O4磁粉的制備

Fe3O4磁粉的制備采用共沉淀法：將摩爾比1∶2的FeCl2·4H2O和FeCl3·6H2O溶于去離子水中，攪拌下滴入濃氨水至pH為8.5，于60 ℃下熟化30 min后過濾，固體用去離子水洗滌4次后于60 ℃下真空干燥，得到黑色Fe3O4磁粉。

1.3 GM的制備和表征

1.3.1 GM的制備

在裝有溫度計、恒速攪拌器、回流管及導氣管的四頸瓶中加入110 mL正庚烷和40 mL四氯乙烯，攪拌下加入硬脂酸鈣和Span 60復合表面活性劑（二者質量比20∶1），混合均勻。在甲酰胺分散0.6 g Fe3O4磁粉的體系中加入2.5 mL甲基丙烯酸縮水甘油酯和4.0 g N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺，混合均勻后轉移至四口燒瓶中。在60 ℃水浴加熱、氮氣保護及偶氮二異丁腈引發下反應5 h。停止反應后在磁場中沉降分離出小球。小球用丙酮洗滌后，室溫真空干燥至恒重，得到GM。

1.3.2 GM的表征

SEM表征采用JEOL公司JSM-6360LV型掃描電子顯微鏡，測試前試樣進行噴金處理；TEM表征采用JEOL 公司JME-2010型透射電子顯微鏡，測試前試樣在聚乙烯醇水溶液中超聲波振蕩分散處理后，取液滴于噴有炭膜的銅網上并進行干燥；比表面積、平均孔徑和孔體積的測定采用Micromeritics公司ASAP-2010型自動物理吸附分析儀，N2吸附質，測定前試樣在50 ℃下真空脫氣10 h；磁化曲線采用Lake Shore 公司7304型振動試樣磁強計（VSM）測定，磁場強度范圍（-1.6～1.6）×106A/ m；表面環氧基團的含量采用硫代硫酸鈉滴定法［21］測定。

1.4 PGA/GM的制備

稱取0.1 g GM，用去離子水潤濕、溶脹、吸去表面水后，依次加入2.0 mL pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液和0.2 mL PGA溶液，于轉速100 r/min的水浴搖床中30 ℃下反應72 h，制備PGA/GM。在磁場中分離出PGA/GM并用去離子水洗至分離液中檢不出蛋白質，然后將PGA/GM浸泡于pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液中儲于冰箱（4 ℃）中備用。

1.5 （R，S）-2-CGM的合成與水解反應

1.5.1 （R，S）-2-CGM的制備

在裝有攪拌器、溫度計和恒壓滴液漏斗的三口燒瓶中加入100 mL甲醇和18.5 g （R，S）-2-氯苯甘氨酸，攪拌下冰水浴冷卻至0 ℃，滴加13 mL的二氯亞砜，緩慢加熱至50 ℃，攪拌下恒溫反應6 h；減壓蒸餾出過量的甲醇和二氯亞砜，剩余物用甲醇-乙醚二元溶劑進行重結晶得到（R，S）-2-氯苯甘氨酸甲酯鹽酸鹽白色晶體，在晶體中加入適量的飽和碳酸氫鈉水溶液至pH=8，靜置2 h后分液，用二氯甲烷溶劑萃取后減壓蒸餾得到淺黃色液體（R，S）-2-CGM。

采用Bruker公司Advance Ⅲ型核磁共振儀（400 MHz）對制備的（R，S）-2-CGM進行NMR分析確認。1H NMR（CDCl3）分析結果：化學位移δ=7.39～7.24（4H，m，ArH），5.01（1H，s，CH），3.72（3H，s，CH3），1.98（2H，s，NH2）；13C NMR（CDCl3）分析結果：δ=173.9，138.1，133.3，129.9，129.2，128.5，127.4，56.1，52.3。

1.5.2 （R，S）-2-CGM的水解反應

在50 mL反應器中依次加入0.1 g （R，S）-2-CGM、10 mL磷酸鹽緩沖溶液（0.1 mol/L，pH=7.8）和0.1 g PGA/GM，置于一定溫度的水浴搖床中在轉速120 r/min下進行反應，一定時間后在磁場中分離出PGA/GM結束反應。反應液由裝有進口手性柱Daicel CrownpackCR（+）的FL-2200-2型高效液相色譜儀（浙江福立分析儀器有限公司）進行分析，波長220 nm。

（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的對映體過量值分別用ees和eep表示，計算方法見式（1）和式（2）：式中，cSS和cRS分別為（S）-2-CGM和（R）-2-CGM的濃度，mol/L；cRP和cSP分別為（R）-2-氯苯甘氨酸和（S）-2-氯苯甘氨酸的濃度，mol/L。

底物總轉化率（X）和對映選擇性參數（E）值分別按式（3）和式（4）計算［22］：

2 結果與討論

2.1 GM的特性

在GM的形成過程中，單體甲基丙烯酸縮水甘油酯的雙鍵發生聚合反應，絕大多數的環氧基團保留在GM表面和體相［23］，利用硫代硫酸鈉滴定法測定GM表面環氧基團含量為0.61 mmol/g。經低溫N2吸附法測定，GM具有多孔結構，比表面積為136 m2/g，平均孔徑和孔體積分別為28.2 nm和0.50 m3/g。

GM的SEM和TEM照片見圖1。由圖1a可知，制備的GM呈很好的球形，微球之間不粘連且分布較均勻，球徑主要在100～200 μm內。由圖1b可看出，GM中Fe3O4顆粒大小在10 nm左右，其周圍包裹著聚合物層。

圖1 GM的SEM（a）和TEM（b）照片Fig.1 SEM（a） and TEM（b） images of GM.

VSM測定結果表明，GM具有超順磁性，飽和磁化率為6.43 emu/g。由于GM中的Fe3O4顆粒被分散包埋在甲基丙烯酸縮水甘油酯與N，N′-亞甲基雙丙烯酰胺交聯聚合的網絡中，削弱了Fe3O4顆粒之間的磁相互作用力，致使GM用作酶固定化載體以及制備的PGA/GM在使用過程中沒有出現磁聚集現象。

2.2 不同酶催化性能的比較

脂肪酶和PGA均屬于水解酶，二者對酯類的水解反應均具有活性。在相同的反應條件下，對PGA和幾種脂肪酶水解（R，S）-2-CGM的催化性能進行了對比，實驗結果見表1。

水解產物的分析結果表明，來自不同菌種的脂肪酶PSL，CCL，CAL-B，在20 ℃時均能催化（R，S）-2-CGM發生水解反應。反應48 h時，90%以上的（R，S）-2-CGM發生了水解反應轉化為（R，S）-2-氯苯甘氨酸，其中，底物（S）-2-CGM優先水解，但生成的S-構型與R-構型的2-氯苯甘氨酸的數量相差很小（前者略多于后者），剩余底物（R，S）-2-CGM中S-構型與R-構型的含量十分接近。這意味著PSL，CCL，CAL-B這3種脂肪酶雖均能催化（R，S）-2-CGM發生水解反應，但對（R）-2-CGM和（S）-2-CGM的識別性很低，導致S-構型與R-構型的底物均發生了反應，水解反應的對映選擇性低。由表1可看出，（S）-2-CGM的ees和（R）-2-氯苯甘氨酸的eep均呈負值，且絕對值均低于3%。

表1 幾種酶對（R，S）-2-CGM水解反應的催化性能Table 1 Catalytic performances of several enzymes for the hydrolysis of （R，S）-2-chlorophenyl glycine methyl ester（2-CGM）

由表1還可看出，與脂肪酶不同，PGA優先催化底物中的（R）-2-CGM發生水解，且對兩種構型2-CGM底物的對映體選擇性遠高于脂肪酶。游離酶PGA在20 ℃下催化水解反應48 h時，（S）-2-CGM的ees為50.4%，（R）-2-氯苯甘氨酸的eep為23.5%，這說明PGA能很好地識別不同構型的2-CGM底物，主要是優先選擇性地催化（R）-2-CGM發生水解反應。PGA經GM固定化后，其水解活性和對映體選擇性均得到大幅提高，在相同的反應條件下，PGA/GM催化（R，S）-2-CGM發生水解反應，（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的ees和eep分別為98.0%和58.8%，E值為9.4，底物總轉化率為62.5%。

2.3 水解反應條件的優化

在不同溫度下進行水解反應，測定不同時間內PGA/GM催化（R，S）-2-CGM發生水解反應的轉化率以及生成（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的ees和eep，實驗結果見表2。由表2可知，升高水解溫度或延長反應時間，（R）-2-氯苯甘氨酸的eep均呈下降趨勢。說明PGA/GM對兩種構型2-CGM底物的識別性隨反應溫度的升高或反應時間的延長而減弱，其原因可能是在相對較高的溫度或較長時間內進行反應，酶的剛性結構變得柔韌，導致其對映體選擇性下降［24］。

表2 反應溫度和時間對PGA/GM催化（R，S）-2-CGM水解反應的影響Table 2 Effects of reaction temperature and time on enantioselectivity of the asymmetric hydrolysis of （R，S）-2-CGM with the PGA/GM catalyst

從目標產物（S）-2-CGM的ees變化可看出，控制反應時間在36 h以內時，反應溫度由10 ℃升至30 ℃，（S）-2-CGM的ees逐漸增大。這是由于升高反應溫度提高了PGA/GM催化（R）-2-CGM水解反應的速率。但在30 ℃下反應時間過長（36 h以上）時，PGA/GM的對映體選擇性下降，導致（S）-2-CGM的ees下降，反而不利于（S）-2-CGM光學純度的提高。綜合考慮反應溫度和時間等因素，利用PGA/GM催化（R，S）-2-CGM發生不對稱水解反應的適宜條件為20 ℃和48 h時，在此條件下可獲得ees為98.0%的（S）-2-CGM。

2.4 PGA/GM的穩定性

在優化的反應時間和溫度下，將PGA/GM重復用于（R，S）-2-CGM水解反應，每次反應后在磁場中分離出PGA/GM，用0.1 mol/L、pH=7.8的磷酸鹽緩沖溶液洗滌3次后，再次用于（R，S）-2-CGM水解反應，重復使用6次（使用間歇時可在4 ℃下儲存），考察PGA/GM的穩定性。實驗結果見圖2。

由圖2可知，PGA/GM重復使用6次后所得（S）-2-CGM的ees仍達93.2%，呈現出良好的穩定性。這是由于Fe3O4磁性粒子分散包埋于GM中，使PGA/GM在使用中不存在磁性物質普遍存在的自聚現象。GM表面存在大量的環氧基團和強親水性的酰胺基團，它們為PGA/GM催化水解反應的活性和對映體選擇性的發揮提供了適宜的微環境。GM借助自身的活性環氧基團共價結合固定PGA，使PGA與載體結合相對牢固，在磁場作用下PGA/GM快速沉降，經多次使用并經分離洗滌幾乎沒有機械操作損失。由此可見，PGA經GM固定化后，不僅活性和對映體選擇性得到了提高，同時具備很好的穩定性，可重復用于（R，S）-2-CGM的水解反應。

圖2 PGA/GM的穩定性Fig.2 Stability of PGA/GM.

3 結論

1） PGA催化（R，S）-2-CGM水解反應時，優先催化底物中的（R）-2-CGM發生水解反應；PGA經GM固定化后，其活性和對映體選擇性均得到大幅提高。

2）利用PGA/GM催化（R，S）-2-CGM水解反應，是一種環境友好的制備氯吡格雷關鍵手性中間體（S）-2-CGM的新方法，在20 ℃下反應48 h，所得（S）-2-CGM和（R）-2-氯苯甘氨酸的ees和eep分別為98.0%和58.8%，底物總轉化率達62.5%。

3）PGA/GM重復用于（R，S）-2-CGM水解反應，在磁場作用下分離和洗滌后循環使用6次，所得（S）-2-CGM的ees仍達93.2%，呈現出良好的穩定性，具有工業化應用前景。

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（編輯 安 靜）

Enzymatic Resolution of (R,S)-2-Chlorophenyl Glycine
Methyl Ester with Magnetically Immobilized Penicillin G Acylase

Xue Ping，Gu Yaohua，Zhang Ligen，Ma Yuan，Li Peng
（State Key Laboratory Cultivation Base of Natural Gas Conversion，Ning Xia University，Yinchuan Ningxia 750021，China）

Penicillin G acylase(PGA) was immobilized on self-made magnetic polymer microspheres(GM) with epoxy groups，macropores and saturation magnetization of 6.5 emu/g to prepare the PGA/GM magnetic immobilized enzyme. The kinetic resolution of racemic (R，S)-2-chlorophenyl glycine methyl ester(2-CGM) through the hydrolysis catalyzed by PGA/GM were investigated. The enantiomeric excess values of (S)-2-CGM and (R)-2-chlorophenyl glycine were 98.0% and 58.8% respectively，and the conversion of (R，S)-2-CGM were 62.5% in the enzymatic hydrolysis under the conditions of 20 ℃ and 48 h. It was observed that the activity and enantioselectivity of PGA for the asymmetric hydrolysis of (R，S)-2-CGM were improved signif cantly by the immobilization. The immobilized enzyme could be recovered easily without mechanical loss and considerably kept its initial activity and enantioselectivity after it was reused six times.

magnetically immobilized Penicillin G acylase；(R，S)-2-chlorophenyl glycine methyl ester； asymmetric hydrolysis； enzymatic resolution； enantioselectivity

1000 - 8144（2014）11 - 1284 - 06

TQ 426.97

A

2014 - 05 - 21；［修改稿日期］ 2014 - 07 - 23。

薛屏（1962—），女，內蒙古自治區錫林浩特市人，博士，教授，電話 0951 - 2062835，電郵 ping@nxu.edu.cn。

國家自然科學基金項目（21263020）；國家重點基礎研究發展計劃前期研究專項項目（2012CB723106）。