水產食品中組胺的丹磺酰氯柱前衍生反相高效液相色譜測定方法的建立及應用

胡家偉，高 榕，曹敏杰，蔡秋鳳，張凌晶，蘇文金，劉光明,*

（1.集美大學生物工程學院，福建 廈門 361021；2.杏林出入境檢驗檢疫局，福建 廈門 361022）

組胺是一種重要的生物活性物質，在體內可以發生多種生理反應[1]。它不僅是炎癥反應和免疫損傷的重要介質之一，而且對應答炎癥反應有著重要的調節作用[2]。但是當人體攝入過量組胺時，會引起組胺中毒。其癥狀主要包括口腔麻木、頭暈、心悸、血壓下降、吞咽困難和口渴等，同時伴有蕁麻疹、皮疹和面部腫大等過敏反應，嚴重者甚至危及生命[3]。組胺中毒事件多發生在一些游離組氨酸含量豐富的鯖科魚類中，如金槍魚、鯖魚、鮐魚等，因為此類中上層魚類死后若不加以合理控制，極易產組胺[4]。因此各國都制定了水產品中組胺的限量標準，美國食品藥品監督管理局（Food and Drug Adiministration，FDA）要求進口水產品的組胺含量不得超過50 mg/kg[5]。歐盟規定鯖科魚類中的組胺含量不得超過100 mg/kg[6]。而我國規定鮐魚中組胺不得超過1 000 mg/kg，其他海水魚中不得超過300 mg/kg[7]。我國魚類資源豐富，水產品在國民經濟和消費中都占有重要地位。但是，每年都會有因組胺含量超標而導致水產食品被禁止出口的事件，使企業蒙受了巨大損失，給水產品出口貿易帶來很大影響。因此，監測水產食品中組胺的水平，控制水產品中組胺的形成對于保障水產食品的質量安全具有重要意義。

目前，水產品中組胺的檢測方法主要有比色法[8-9]、薄層色譜法[10-11]、酶聯免疫吸附法[12-13]、生物傳感器法[14-15]、毛細管電泳法[16-17]和高效液相色譜法等[18-21]。其中高效液相色譜法具有檢測靈敏度高、線性關系良好、分析定量準確等優點，是目前水產品組胺含量分析測定的主要手段。由于組胺既沒有紫外發色基團也沒有熒光發色基團，因此在檢測前一般要先對組胺進行衍生化處理。丹磺酰氯（dansyl chloride，Dns-Cl）作為液相色譜柱前衍生試劑具有衍生操作簡單、衍生物穩定性好、可定量完成磺酰化反應、有較強的熒光和紫外吸收、靈敏度高、反應范圍寬、基體干擾不明顯等優點[22]。本研究以Dns-Cl作為組胺的柱前衍生劑，采用反相高效液相色譜對組胺進行定量分析，優化了組胺的最適衍生條件和色譜條件，建立了快速檢測水產食品中組胺的方法，與國內其他學者的高效液相色譜法[18-20]相比較，該方法具有衍生反應時間短、組胺檢出時間早等優點，縮短了樣品的前處理時間和檢測時間，提高了檢測效率。此外，還研究了鰹魚、鯖魚和藍圓鲹在不同貯藏溫度條件下組胺的變化情況，以探索控制水產品中組胺的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鰹魚、鯖魚、秋刀魚、藍圓鲹、大黃魚、鰻魚、鯉魚、羅非魚、南美白對蝦、克氏原螯蝦、擬穴青蟹、梭子蟹、菲律賓蛤仔、雜色鮑、章魚和魷魚16 種水產品廈門集美菜市場和廈門第八農貿市場；魚露、魚醬、淡水魚糜、鹽漬巴浪魚、鹽漬銀魚、石斑魚魚片、鱈魚魚片、鰻魚魚片、桂花魚魚片、小黃魚魚片、紅娘魚魚片、鯖魚罐頭、鯪魚罐頭、鳳尾魚罐頭、沙丁魚罐頭、小銀魚罐頭、馬面魚罐頭、紅娘魚罐頭和蟹肉罐頭19種水產加工食品 廈門集美新華都超市和廈門集美永輝超市；冷凍鰹魚、鯖魚和藍圓鲹由福建省石獅市瑞興冷凍食品有限公司提供，實驗前一直儲存于－30 ℃冰箱。

組胺二鹽酸鹽（CAS號：56-92-8，純度99%） 比利時Acros Organics公司；丹磺酰氯（純度99%） 美國Sigma公司；丙酮（色譜純） 上海化學試劑研究所；三氯乙酸（分析純） 西隴化工股份有限公司；氫氧化鈉（分析純） 廣東光華化學廠有限公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher Scientific公司；實驗用水由Millipore Milli-Q Academic超純水系統制備。

1.2 儀器與設備

1260高效液相色譜儀（配有G1311C四元泵、G1329B自動進樣器、G1316A柱溫箱、G1314F紫外檢測器（variable wavelength detector，VWD）和B.04.03液相化學工作站） 美國Agilent公司；高速冷凍離心機 德國Sigma公司；組織搗碎機 瑞士Kinematica公司；恒溫水浴鍋 德國Memmert公司。

1.3 方法

1.3.1 組胺標準溶液的配制和衍生

準確稱取組胺二鹽酸鹽標準品0.5 g于50 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，配制成質量濃度為10 mg/mL的組胺標準儲備液，避光，4 ℃保存。吸取1 mL組胺標準儲備液于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋，采用逐級稀釋法分別得到質量濃度為1、5、10、20、50、100、200、500 μg/mL的組胺標準溶液，現配現用。

取300 μL組胺標準溶液于2 mL的離心管中，加入40 μL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，再加入600 μL 10 mg/mL Dns-Cl溶液，蓋塞混勻后，置于40 ℃恒溫水浴鍋內反應20 min。加入100 μL氨水，混勻，靜置30 min。用乙腈定容至1.5 mL，振蕩混勻后，過0.22 μm的有機相針式濾器后待測。

1.3.2 樣品的提取和衍生

準確稱取5.0 g樣品于50 mL離心管中，加入15 mL 5%三氯乙酸搗碎勻漿，4℃、6 000×g離心15 min，上層清液移入25 mL棕色容量瓶中。沉淀物再加10 mL 5%三氯乙酸按照上述操作重復提取1 次，上清液合并于容量瓶中，5%三氯乙酸定容至刻度，過0.22 μm的水相針式濾器。

取300 μL樣品提取液于2 mL的離心管中，加入40 μL 2 mol/L氫氧化鈉溶液，調pH值至9.5左右，再加入600 μL 10 mg/mL Dns-Cl溶液，蓋塞混勻后，置于40 ℃恒溫水浴鍋內反應20 min。反應完畢后，加入100 μL氨水，混勻，靜置30 min。乙腈定容至1.5 mL，振蕩混勻后，4 ℃、10 000 r/min離心5 min，上清液過0.22 μm的有機相針式濾器后待測。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX Extend-C18色譜柱（50 mm×4.6 mm，5 m）；流動相：乙腈-水（70∶30，V/V）；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：20 L；紫外檢測波長：254 nm。

2 結果與分析

2.1 組胺衍生條件的確定

2.1.1 Dns-Cl質量濃度的確定

Dns-Cl的用量是影響衍生反應的重要因素，為了選擇一個合適的Dns-Cl質量濃度，本實驗測定了300 μL 100 μg/mL的組胺標準溶液添加600 μL質量濃度分別為1、3、5、8、10 mg/mL的Dns-Cl溶液衍生反應的完全程度。每個質量濃度點做3次平行取測量值的平均值。分析Dns-Cl質量濃度對組胺衍生物峰面積的影響，結果如圖1所示，組胺衍生物的生成量隨著Dns-Cl質量濃度的增大而增加，當Dns-Cl質量濃度達到10 mg/mL時，組胺與Dns-Cl完全反應，組胺衍生物的生成量基本趨于穩定。因此，為了保證衍生反應的徹底完成，選用10 mg/mL的Dns-Cl作為衍生劑。

圖 1 Dns-Cl質量濃度對組胺衍生物峰面積的影響Fig.1 Effect of dansyl chloride concentrations on peak area of histamine derivative

2.1.2 衍生反應pH值的確定

組胺和Dns-Cl在堿性條件下才能發生反應，因此選擇用0.1 mol/L的氫氧化鈉溶液將反應體系的pH值分別調至8.0、8.5、9.0、9.5和10.0，每個pH值點做3 次平行取測量值的平均值。分析衍生反應pH值對組胺衍生物峰面積的影響，結果如圖2所示，組胺衍生物的生成量隨著pH值的增大逐漸增加，pH為9.5時，組胺衍生物的生成量最大，此時0.1 mol/L氫氧化鈉溶液的添加量為40 μL。當pH值繼續增大至10.0時，組胺衍生物的生成量下降，因此衍生反應的最適pH 9.5。

圖 2 衍生反應pH值對組胺衍生物峰面積的影響Fig.2 Effect of derivative reaction pH on peak area of histamine derivative

2.1.3 衍生反應溫度的確定

將反應體系分別在30、40、50、60 ℃和70 ℃條件下反應30 min。每個溫度點做3 次平行取測量值的平均值。分析衍生反應溫度對組胺衍生物峰面積的影響，結果如圖3所示，組胺衍生物的生成量隨著溫度的增加呈現先上升后下降的趨勢，反應溫度為40 ℃時，組胺衍生物的生成量最大。因此衍生反應的最適反應溫度為40 ℃。

圖 3 衍生反應溫度對組胺衍生物峰面積的影響Fig.3 Effect of derivative reaction temperature on peak area of histamine derivative

2.1.4 衍生反應時間的確定

圖 4 衍生反應時間對組胺衍生物峰面的影響Fig.4 Effect of derivative reaction time on peak area of histamine derivative

將反應體系在40 ℃條件下分別反應10、20、30、40、50、60 min。每個時間點做3 次平行取測量值的平均值。分析衍生反應時間對組胺衍生物峰面積的影響，結果如圖4所示，反應時間增加至20 min時，組胺衍生物的生成量最大。之后隨著反應時間的繼續延長，組胺衍生物的生成量逐漸減少，因此衍生反應的最適反應時間為20 min。而邢麗紅等[18]研究的高效液相色譜紫外檢測法組胺的衍生反應時間需要60 min。

以上結果表明，衍生反應的最適條件為Dns-Cl質量濃度10 mg/mL、衍生反應pH 9.5、溫度40 ℃、反應時間20 min。

2.2 色譜圖與標準曲線

依據本實驗建立的最適衍生條件和色譜條件，組胺的保留時間在5.5 min左右，且峰形良好，表明該方法快速準確。與肖琴等[19]的高效液相色譜法相比，組胺的保留時間由21.5 min提前至5.5 min，提高了檢測效率。100 μg/mL組胺標準品的色譜圖見圖5。分別配制質量濃度為1、5、10、20、50、100、200、500 μg/mL的組胺標準溶液按1.3.1節中的衍生方法和1.3.3節中的色譜條件進行測定，以組胺衍生物色譜峰面積（y）為縱坐標，以相應的組胺質量濃度（x）為橫坐標，繪制標準曲線。組胺標準溶液在1～500 μg/mL范圍內，峰面積與質量濃度的線性關系良好，其線性回歸方程為y=32.166x－5.496 5，R2=0.999 9。

2.3 精密度、檢出限和定量限的確定

對10 μg/mL的組胺標準溶液連續進樣10 次，組胺的保留時間穩定且峰面積的相對標準偏差為0.19%，小于3%，說明儀器精密度良好。將組胺標準溶液稀釋成不同的低濃度溶液，通過測定信噪比（RSN）來確定檢出限（RSN=3）和定量限（RSN=10）。結果發現，組胺標準溶液質量濃度為0.5 μg/mL時，RSN=3，組胺標準溶液質量濃度為1.0 μg/mL時，RSN=10。因此，儀器的檢出限為0.5 μg/mL，定量限為1.0 μg/mL。

2.4 樣品的檢測

采用該方法測定了16 種水產品和19 種水產加工食品中的組胺，每種樣品做3 次平行取測量值的平均值。由表1可見，鰹魚、鯖魚、秋刀魚和藍圓鲹等青皮紅肉魚均有檢出組胺，而其他白肉魚（大黃魚、鰻魚、鯉魚和羅非魚）以及甲殼類（南美白對蝦、克氏原螯蝦、擬穴青蟹和梭子蟹），貝類（菲律賓蛤仔和雜色鮑）和軟體動物（章魚和魷魚）等均未檢出，說明組胺的分布同水產品種有密切的聯系。通常組氨酸是組胺產生的前體物質，而組氨酸以咪唑二肽的形式存在于水產品中，游離的組氨酸與咪唑二肽是支撐水產品活潑運動時的緩沖物質。對于游泳能力強的魚類，其肌肉中組氨酸與咪唑二肽含量較多，所以這些水產品腐敗時可能會產生大量的組胺。然而，貝類、烏賊、章魚、蝦、蟹類動物的運動能力相對較弱，其肌肉中幾乎沒有游離組氨酸和咪唑二肽[23]，所以幾乎不會產生組胺。

n=3）=3 Table 1 Histamine contents in aquatic products samples (表 1 不同水產品中組胺的含量（Table 1 Histamine contents in aquatic products samples (n = 3) = 3)mg/kg樣品名稱 組胺含量 樣品名稱 組胺含量鰹魚 4.72±0.81 南美白對蝦 ND鯖魚 10.52±0.56 克氏原螯蝦 ND秋刀魚 23.25±0.95 擬穴青蟹 ND藍圓鲹 9.30±0.64 梭子蟹 ND大黃魚 ND 菲律賓蛤仔 ND鰻魚 ND 雜色鮑 ND鯉魚 ND 章魚 ND羅非魚 ND 魷魚 ND注：含量為“平均值±標準偏差”；ND.未檢出（組胺含量低于0.5 mg/kg）。下同。表 2 不同水產加工食品中組胺的含量（n=3）=3 Table 2 Histamine contents in processed aquatic products samples (Table 2 Histamine contents in processed aquatic products samples (n n = 3)= 3)mg/kg樣品名稱 組胺含量 樣品名稱 組胺含量魚露 682.22±10.90 紅娘魚魚片 ND魚醬 241.04±8.27 鯖魚罐頭 116.55±2.32淡水魚糜 ND 鯪魚罐頭 ND鹽漬巴浪魚 31.46±0.69 鳳尾魚罐頭 4.12±0.20鹽漬銀魚 ND 沙丁魚罐頭 48.36±0.62石斑魚魚片 ND 小銀魚罐頭 37.00±3.12鱈魚魚片 44.07±0.52 馬面魚罐頭 11.69±1.21鰻魚魚片 ND 紅娘魚罐頭 17.87±1.44桂花魚魚片 ND 蟹肉罐頭 ND小黃魚魚片 ND

由表2可見，魚露、魚醬等發酵食品中的組胺很高，含量為682.22、241.04 mg/kg，嚴重超出了美國FDA的限量標準[5]。魚罐頭也幾乎全部都有組胺檢出，含量在4.12～116.55 mg/kg之間，其中鯖魚罐頭中組胺含量達116.55 mg/kg，也超出了美國FDA的限量標準[5]。而魚片食品僅有鹽漬巴浪魚和鱈魚魚片有組胺檢出。說明水產加工食品中發酵食品由于有利于微生物的生長最容易產生組胺，其次是罐頭食品，而魚片食品由于水分含量低不利于微生物的生長，因此組胺較低。

2.5 樣品的組胺加標回收率

選擇擬穴青蟹、梭子蟹、魚露和沙丁魚罐頭4 種樣品為研究對象，分別添加一定量的組胺標準溶液（20、50、100 mg/kg），每個加標水平平行測定3 次，計算不同加標水平的回收率和平均回收率，結果見表3。樣品添加不同質量濃度的組胺，平均回收率在89.54%～101.92%，說明該方法準確性較高。

表 3 4 種樣品的組胺加標回收率Table 3 Recoveries of histamine from 4 spiked samples Table 3 Recoveries of histamine from 4 spiked samples%樣品名稱 添加量/（mg/kg） 平均回收率（n=9） RSD（n=9）20 50 100擬穴青蟹 96.69±1.97 98.70±0.84 94.96±1.75 96.78 1.87梭子蟹 93.93±0.99 84.01±0.77 90.69±0.27 89.54 5.65魚露 99.43±0.85 99.68±0.97 101.67±0.46 100.26 1.23沙丁魚罐頭 104.41±0.76 99.74±0.53 101.61±0.69 101.92 2.30

2.6 不同貯藏溫度條件下組胺的變化情況

2.6.1 鰹魚、鯖魚和藍圓鲹在25 ℃貯藏條件下的組胺變化情況

分別將冷凍鰹魚、鯖魚和藍圓鲹解凍后取肉，放置于25 ℃貯藏48 h，每隔6 h測定1 次組胺含量，每個時間點做3 次平行取平均值，結果如圖6所示，前12 h 3 種魚中的組胺含量變化都很小，12 h以后鯖魚中的組胺含量呈指數型增長，到24 h時組胺含量已經達到3 097.62 mg/kg，之后趨于穩定。18 h以后鰹魚和藍圓鲹中的組胺含量開始呈指數型增長，42 h時鰹魚和藍圓鲹中的組胺含量分別達到了7 902.70 mg/kg和2 487.88 mg/kg，之后趨于穩定。當25 ℃貯藏48 h后，鰹魚、鯖魚和藍圓鲹中的組胺含量分別達到了8 484.82、3 760.35 mg/kg和2 531.29 mg/kg，這可能是由于在25 ℃貯藏時，產組胺菌在魚肉中迅速生長繁殖，產生大量組胺。

2.6.2 鰹魚、鯖魚和藍圓鲹在4 ℃貯藏條件下的組胺變化情況

分別將冷凍鰹魚、鯖魚和藍圓鲹解凍后取肉，放置于4 ℃條件下貯藏1 周，每隔1 d測定一次組胺含量，每個時間點做3 次平行取平均值，結果如圖7所示，隨著時間的延長，3 種魚中的組胺含量逐漸增加，但相比25 ℃貯藏增加幅度不明顯，貯藏1 周后，鰹魚、鯖魚和藍圓鲹中的組胺含量分別達到了88.66、79.24 mg/kg和61.00 mg/kg，均低于100 mg/kg，說明4 ℃貯藏能夠較好的控制魚肉中組胺的增加。

2.6.3 鰹魚、鯖魚和藍圓鲹在－30 ℃貯藏條件下的組胺變化情況

分別將冷凍鰹魚、鯖魚和藍圓鲹解凍后取肉，在－30 ℃貯藏7、14、21 d和28 d后的組胺含量，結果發現樣品中組胺均未檢出。結合3 種魚在25 ℃和4 ℃貯藏的結果可以發現，溫度越高越有利于組胺的產生，低溫貯藏則可以有效抑制組胺的產生。

3 結 論

本實驗采用Dns-Cl柱前衍生反相液相色譜法測定水產食品中的組胺，與我國出入境檢驗檢疫行業標準[24]相比，樣品的衍生時間由45 min縮減至20 min，組胺的保留時間由14.2 min提前至5.5 min，定量限由10 μg/mL降低至1.0 μg/mL。由此可見該方法縮短了樣品的衍生時間和檢測時間，提高了檢測效率和靈敏度，表明其快速準確、靈敏度高、重復性好，適用于水產食品中組胺的測定。

采用該方法測定了不同水產品和水產加工食品中的組胺，結果顯示受檢樣品的組胺含量在0～682.22 mg/kg之間，其中魚露、魚醬和鯖魚罐頭均超過了美國FDA規定的限量標準[5]，且大部分魚類罐頭食品均有組胺檢出，說明我國水產食品質量安全存在一定的風險。進一步運用該方法監測了鰹魚、鯖魚和藍圓鲹貯藏在不同溫度下的組胺變化情況。結果發現，25 ℃貯藏48 h后3 種魚的組胺都超過了2 000 mg/kg，4 ℃貯藏1 周后3 種魚的組胺均在100 mg/kg以下，而－30 ℃貯藏樣品中組胺則均未檢出。這與文獻[25]報道的藍圓鲹在不同貯藏溫度條件下組胺的變化規律相一致，說明溫度越高越有利于組胺的產生，低溫貯藏可有效抑制組胺產生。

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