紫外線抵抗相關基因在二烯丙基二硫誘導人白血病K562細胞自噬中的作用

王 萍，殷小成，彭艷輝，胡賢嬌，楊云華

（南華大學附屬第一醫院兒科，湖南衡陽421001）

紫外線抵抗相關基因在二烯丙基二硫誘導人白血病K562細胞自噬中的作用

王 萍，殷小成，彭艷輝，胡賢嬌，楊云華

（南華大學附屬第一醫院兒科，湖南衡陽421001）

目的觀察紫外線抵抗相關基因（UVRAG）在二烯丙基二硫（DADS）誘導白血病K562細胞自噬中的作用。方法以K562細胞為細胞模型，利用透射電鏡觀察細胞的超微結構自噬體的形成；采用吖啶橙染色和熒光顯微鏡觀察酸性囊泡的形成以檢測DADS誘導K562細胞自噬；RT-PCR檢測自噬相關基因UVRAG mRNA的表達水平。結果透射電鏡顯示：與空白組和溶媒組比較，DADS（40 mg·L-1）處理組可觀察到胞質內出現大量自噬體。吖啶橙染色熒光顯微鏡下可見到各DADS處理組K562細胞胞漿中的酸性囊泡較空白組和溶媒組明顯增多。RT-PCR結果顯示，DADS作用K562細胞12h后，各DADS處理組UVRAG mRNA表達水平均高于空白組和溶媒組。結論DADS能誘導K562細胞自噬，其機制可能與上調UVRAG mRNA表達有關。

二烯丙基二硫；白血病；K562細胞；自噬；紫外線抵抗相關基因

自噬性細胞死亡又稱為Ⅱ型程序性細胞死亡，與腫瘤的發生、發展及轉移密切相關，已成為腫瘤研究領域的一個熱點［1］。隨著分子生物學的進步和對自噬的深入探索，自噬在白血病中扮演的角色日益清晰，將為白血病治療提供一個新的靶點。二烯丙基二硫（diallyl disulfide，DADS）是大蒜中提取出的一種有機硫化物，是脂溶性物質，對乳腺癌、肝癌、肺癌、胃癌、結腸癌和白血病等的細胞均有抑制作用［2］。本課題組前期研究［3］發現DADS可以誘導人白血病K562細胞發生凋亡，且呈時間和劑量依賴性。然而關于DADS誘導腫瘤細胞發生自噬的研究鮮有報道。本實驗從自噬角度探討DADS能否誘導K562細胞發生自噬性死亡及其相關的分子機制，為DADS進一步研究及應用于臨床提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑DADS購自美國Fluka公司，按說明書用二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶解配制，配置比例為1∶2，再加入質量分數0.9%氯化鈉溶液進行稀釋，稀釋的倍數為100倍，DMSO終濃度＜0.01%；胎牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司；RPMI-1640培養基購自美國HyClone公司；Trizol購自美國GIBCOBRL公司；逆轉錄試劑盒購自加拿大Fermentas公司，PCR試劑盒購自廣州東盛生物工程公司，PCR引物由美國Invitrogen公司合成；吖啶橙染色劑購自江蘇碧云天生物技術公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養及分組 K562細胞株購自北京協和細胞中心，細胞生長于含體積分數12%滅活新生胎牛血清的RPMI-1640完全培養基中，置于37℃、體積分數5%CO2飽和濕度培養箱內培養，每2 d換液1次。實驗分為3個大組：空白組、溶媒組及DADS處理組。空白組不加DMSO，溶媒組加有同最高DADS濃度處理組等量體積的DMSO，DADS組分為10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1DADS 4個亞組，每個亞組重復實驗3次。取對數生長期細胞進行實驗。

1.2.2 透射電鏡檢測細胞自噬現象 收集空白組、溶媒組、DADS（40 mg·L-1）處理組作用12 h后的細胞，PBS洗滌細胞2次，800 r·min-1離心5 min，沿管壁逐滴加入質量分數3%戊二醛固定過夜，經環氧樹脂包埋，制成半薄片進行定位，制成超薄片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛染色后，定位觀察并拍照。觀察到自噬小體為陽性，未觀察到自噬小體為陰性。

1.2.3 吖啶橙單染熒光顯微鏡觀察細胞自噬 取對數生長期K562細胞，用含體積分數12%滅活新生胎牛血清RPMI-1640培養基制成3.0×106mL-1的單細胞懸液，接種于無菌6孔培養板中，每孔2 mL。收集分別培養12 h后的空白組、溶媒組和各DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）處理組細胞，離心去液體，每管加入0.1 mg·L-1吖啶橙1 mL重懸，避光，放置于37℃、體積分數5%CO2培養箱中15 min，然后800 r·min-1離心5 min，去上清液，PBS洗滌2次，留取20 μL細胞懸液滴于載玻片上蓋片封片后在熒光顯微鏡下觀察形態學。如吖啶橙的綠色熒光轉變成紅色熒光說明細胞內酸性囊泡增多［4］。

1.2.4 RT-PCR檢測UVRAG mRNA的表達 3 7℃、飽和濕度、體積分數5%CO2培養箱培養12 h后，收集細胞，PBS洗2次。依據TRIZOL試劑盒說明書提取總RNA，波長260/280 nm處測定其濃度和純度；按照Fermentas逆轉錄試劑盒說明合成cDNA待用。紫外線抵抗相關基因（ultraviolet radiation resistance-associated gene，UVRAG的上游引物為5'-ATCTGTGTCTTGTTTCGTGGTG-3'，下游引物為5'-ATGAAGCCGTAGCAAAGAGAAG-3'，產物長度為277b p；內參GAPDH的上游引物為5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物為5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產物長度為452 bp。擴增條件均為：94℃預變性2 min，變性溫度94℃、45 s，退火溫度53℃、50 s，延伸溫度72℃、50 s，72℃、5 min，共35個循環，最后4℃保存。PCR產物各20 μL，在12 g·L-1瓊脂糖凝膠中電泳分離，并在紫外燈下顯影拍照。結果用AlphaImager 2200分析圖像分析軟件對PCR凝膠電泳圖像進行灰度掃描，以目的基因與內參基因比值表示目的基因mRNA的相對表達量。

1.2.5 統計學處理 采用SPSS 13.0進行統計學分析，計量資料s表示，2組之間比較用t檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 透射電鏡檢測細胞自噬現象DADS（40 mg·L-1）作用于K562細胞12 h后，電鏡下可觀察到細胞胞質內有較多具有雙層膜結構的自噬小體，呈圓形或新月形；內含未消化的胞漿成分或細胞器；空白組、溶媒組細胞形態結構規則，細胞核染色質均一，線粒體內嵴規則。提示DADS可誘導K562細胞發生自噬。見圖1。

2.2 吖啶橙染色熒光顯微鏡觀察細胞自噬現象自噬溶酶體的形成是自噬發生的重要標志之一，自噬溶酶體在細胞內是以酸性囊泡細胞器形式存在的。吖啶橙染色后發現，與空白組、溶媒組比較，不同濃度DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）處理K562細胞12 h后，細胞胞漿中可呈現較多紅色斑點狀的酸性囊泡（即為自噬小體）。進一步證實DADS可誘導K562細胞發生自噬。見圖2。

圖1 K562細胞超微結構

圖2 不同濃度DADS處理12 h后K562細胞中酸性囊泡的分布情況

2.3 RT-PCR檢測UVRAG mRNA的表達情況不同濃度 DADS作用 K562細胞12 h后，空白組的UVRAG mRNA相對表達量為0.554±0.018，與溶媒組的0.572±0.018差異無統計學意義（P＞0.05）；UVRAG mRNA相對表達量隨著DADS濃度增大明顯增多，電泳條帶變亮，10 mg·L-1組UVRAG mRNA相對表達量為0.621±0.025，20 mg·L-1組為0.671± 0.019，40 mg·L-1組為0.812±0.009，80 mg·L-1組為0.738±0.044，均高于空白組和溶媒組（P＜0.05），且不同濃度處理組之間兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 RT-PCR法檢測UVRAG mRNA表達情況

3 討論

自噬性細胞死亡作為非細胞凋亡死亡的一種主要方式在惡性腫瘤的發生、發展中起著十分重要的作用。自噬是指一些需降解的蛋白質和細胞器等胞漿成分被包裹，并最終運送至溶酶體形成自噬溶酶體降解的過程，生命體借此維持蛋白代謝平衡及細胞內環境的穩定［5］。目前，自噬已經成為繼凋亡之后生物醫學最熱門的研究領域之一，自噬與腫瘤之間的關系成為了研究熱點［6］。在對乳腺癌、前列腺癌、結腸癌使用抗腫瘤藥物的研究中都出現了自噬性細胞死亡［7］。

自噬體和自噬溶酶體的形成是自噬性細胞死亡的重要形態學標志。透射電鏡下細胞超微結構的形態學檢測被認為是檢測自噬體的金標準，也是首先發現并報道自噬的方法［8］。本實驗采用透射電鏡觀察發現DADS（40 mg·L-1）處理組較空白組和溶媒組形成了大量自噬體，從而從形態學證實了DADS可誘導K562細胞發生自噬。吖啶橙是一種熒光色素，在細胞質和細胞核中呈綠色熒光，而在自噬酸性囊泡中呈紅色熒光。故本研究利用吖啶橙染色，通過熒光顯微鏡觀察不同濃度 DADS（10 mg·L-1、20 mg·L-1、40 mg·L-1、80 mg·L-1）作用K562細胞12 h后自噬的發生、發展變化，結果顯示不同濃度DADS處理組較空白組、溶媒組細胞內紅色熒光的酸性囊泡明顯增加。進一步證實DADS可誘導K562細胞發生自噬。

UVRAG基因是Vps38的哺乳動物同源基因，作為腫瘤抑制基因被人所熟知，廣泛參與乳腺癌、胃癌、結直腸癌等惡性腫瘤的發生、發展［9］。同時，UVRAG在細胞的自噬中發揮著關鍵性的作用。UVRAG可與Beclin 1相結合形成多蛋白復合物UVRAG-Beclin1-Ptdins3KC3參與自噬小體的形成［10］。為進一步探討DADS誘導K562細胞自噬發生的分子機制，本研究采用RT-PCR技術在基因轉錄水平檢測了UVRAG mRNA表達，結果顯示：不同濃度DADS處理K562細胞12 h后UVRAG mRNA的相對表達量均高于空白組和溶媒組，提示DADS誘導K562細胞自噬的作用機制可能與UVRAG mRNA上調有關。

綜上所述，DADS可誘導K562細胞發生自噬，其機制可能與UVRAG mRNA上調有關。越來越多的研究［11］表明自噬與凋亡存在著內在的聯系，然而，在白血病的相關研究中，自噬和凋亡的關系卻很少涉及。本課題組前期研究發現DADS對K562細胞有促凋亡作用，且呈時間和劑量依賴性發生凋亡，且最高凋亡率是在40 mg·L-1DADS處理K562細胞后出現，結合本實驗結果，40 mg·L-1DADS處理K562細胞后自噬發生最明顯，我們有理由相信DADS誘導K562細胞凋亡與自噬之間存在一定的關系，自噬的發生在對DADS誘導K562細胞凋亡時起著什么作用有待進一步研究。

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［4］ Xie SQ，Zhang YH，Li Q，et al.3-Nitro-naphthalimide and nitrogen mustard conjugate NNM-25 induces hepatocellular carcinoma apoptosis via PARP-1/p53 pathway［J］.Apoptosis，2012，17（7）：725 -734.

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［11］Scarlatti F，Granata R，Meijer AJ，et al.Does autophagy have a license to kill mammalian cells？［J］.Cell Death Differ，2009，16（1）：12-20.

Value of Ultraviolet Radiation Resistance-associated Gene in the Diallyl Disulfide Induced Autophagy of Leukaemia K562 Cells

Wang Ping，Yin Xiaocheng，Peng Yanhui，Hu Xianjiao，Yang Yunhua
（Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Nanhua University，Hengyang 421001，China）

ObjectiveTo observe the value of ultraviolet radiation resistance-associated gene（UVRAG）in the diallyl disulfide（DADS）induced autophagy of K562 cells.MethodsK562 cells were chosen for this study.Their ultrastructure was observed by transmission election microscopy.The formation of autophagic vacuoles were observed by fluorescence microscope after acridine orange staining.RT-PCR was used to detect the expression levels of UVRAG mRNA.ResultsCompared with the blank group and the menstruum group，large amount of autophagosomes were observed in the cytoplasm of K562 cells treated with DADS（40 mg·L-1）；amount of autophagic vacuoles observed in all the DADS treatment groups were observed；the UVRAG mRNA expression levels were higher in all the DADS treatment groups after DADS treatment for 12 h（P＜0.05）.ConclusionDADS can induce autophagy of K562 cells，it may be related to the up-regulation of UVRAG mRNA expression.

diallyl disulfide；leukaemia；K562 cells；autophagy；ultraviolet radiation resistance-associated gene

10.3969/j.issn.1673-5412.2014.02.001

R733.7；R730.23

A

1673-5412（2014）02-0093-04

2014-01-02）

國家自然科學基金資助項目（編號：31271482）

王萍（1988-），女，碩士在讀，住院醫師，主要從事小兒白血病基礎研究。E-mail：wangping7048@sina.com

殷小成（1969-），男，教授，主任醫師，碩士生導師，主要從事小兒白血病基礎與臨床研究。E-mail：xcyin108@sina.com