刺參腸道微生物組成分析及產酶、溶血性試驗

張喜昌,費世洲,常亞青,劉小林,王高學

(1.大連海寶漁業有限公司,遼寧 旅順 116045;2.西北農林科技大學 動物科技學院,陜西 楊凌 712100;3.大連海洋大學 農業部北方海水增養殖重點實驗室,遼寧 大連 116023)

海參是一種名貴海產動物,屬于棘皮動物門(Echinodermata),是海參綱(Holothurioidea)動物的泛稱。我國范圍內的海參有20種可以食用。品質優良的食用海參不僅肉質軟嫩,營養豐富,滋味腴美,風味高雅,而且具有生精益腎,固元助本的藥用功效,是久負盛名的名饌佳肴。據《本草綱目拾遺》記載: 海參,味甘咸,補腎,益精髓,其性溫補,足敵人參,故名海參。現代研究表明,海參具有提高記憶力、延緩衰老、固本培元等功效。

海參中的具有極高營養價值的品種——刺參(Apostichopus japonicus)一直以來就是八大海珍之一。刺參的蛋白質含量在55 % 以上,并且脂肪含量極低,只有 1.85 %,氨基酸種類全面,含量均衡,并且含有維生素B1,B2,B6,維生素A,維生素D,維生素E ,以及豐富的礦物元素,如Mn,Fe,Zn,Co,Se 等[1-2]。

隨著市場需求的激增,近年來刺參已成為我國最重要的海水養殖品種。但是,在養殖集約化程度不斷提高的過程中,水產養殖環境日益惡化和刺參種質資源逐步退化等原因,使刺參養殖的各個階段病害頻發,嚴重制約了該產業的健康持續發展[3]。傳統的病害防治手段主要是使用抗生素及化學藥物。由于缺乏明確的藥物使用準則,抗生素和化藥濫用、亂用的現象非常普遍,這些問題進一步導致了影響更為嚴重的耐藥性及藥物殘留等問題,最終給水產品安全帶來嚴重的危機[4]。

尋找安全有效的防治刺參病害的方法,成為目前刺參養殖業亟待解決的問題。益生菌是一類通過改善宿主腸道菌群生態平衡而發揮有益作用,從而提高宿主健康水平和健康狀態的活菌制劑。益生菌作為一種高效、安全的病害防治手段受到越來越多的關注[5]。目前在國內水產養殖中應用的益生菌主要有光合細菌、拮抗菌、營養和產消化酶菌群(乳酸菌、酵母菌等)以及改善水質菌群(硝化細菌、反硝化菌等)。我國水產動物益生菌大多來自于畜禽益生菌的簡單移植,基于水產動物本身的益生菌研究尚未大規模展開。陸源益生菌在水產養殖生物體內難以定植,并且存在以下問題: ①破壞水域環境中的微生態平衡;②利用效率低導致過度使用;③作為海水魚的主養模式——網箱養殖無法施加。所以,從水產養殖動物體內或其生存的天然環境中直接分離篩選高效、可定植益生菌的研究已經得到越來越多的認可。

益生菌在調節并維持機體腸道微生態平衡、幫助營養物質的消化吸收等方面發揮著重要作用,Gate[6]認為,健康動物中正常的優勢菌或次優勢菌可以作為益生菌的來源。本研究以人工養殖的刺參和野生刺參為研究對象,采用純培養的方法分析刺參腸道微生物組成,并對刺參腸道細菌進行了產酶試驗分析,這對于刺參專用益生菌的研發具有十分重要的意義。益生菌必須滿足其施用對象的安全性要求,而溶血性檢測是體外檢驗細菌安全性的一條有效途經,同時大規模的溶血性試驗,有助于我們正確認識動物腸道菌群與機體致病間的聯系。本文在分析刺參腸道微生物組成及產酶試驗的基礎上,對初步篩選出的一批細菌(99株)進行了溶血性檢測,一方面為刺參益生菌的研發提供了參考,另一方面也為機體致病機理的研究提供一些數據資料。試驗確定了 6株細菌作為刺參腸道潛在益生菌,為進行刺參腸道益生菌的體內篩選奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采集健康的野生刺參和養殖刺參各30頭,其中野生刺參在 2011年10月由潛水員采自遼寧省旅順海域,平均體重40.6 g ± 0.5 g,平均體長 10.1 cm ±1.0 cm;養殖刺參由遼寧省大連海寶漁業有限公司提供,平均體重32.1 g ± 0.5 g,平均體長7.6 cm ± 1.0 cm。

1.2 腸道菌的培養、分離和純化

試驗設置 4個處理組,分別為養殖刺參之腸壁組、內容物組和野生刺參之腸壁組、內容物組。腸道菌的培養、分離和純化,參照Sawabe等[7]方法,先用75 % 酒精沖洗實驗刺參體表,在無菌條件下,用剪刀剪開刺參體腔,取出刺參消化道,用 0.9 % 生理鹽水沖洗腸道外壁,擠出腸道內容物。將采集的養殖和野生刺參的腸道內容物和腸壁分別置于無菌試管中,稱重后,分別置于研缽內,用 5 mL無菌生理鹽水充分研磨為均勻樣品。用無菌生理鹽水對樣品進行倍比稀釋至 10–6,各稀釋度樣品均用旋窩振蕩器震蕩均勻。選取合適濃度梯度,分別取100 μL涂布2216E平板,每個濃度下設置 3個重復,28℃條件下培養5 d。培養后選菌落生長分布均勻的平板進行菌落計數。選擇細菌菌落數在30～300的平板,隨機挑取40個單菌落并編號,在2216培養基上多次劃線分離純化,直到得到純種菌株為止。將得到的純種菌株保存于–80℃備用。

1.3 細菌鑒定

采用細菌基因組提取試劑盒(Bioteke)提取單克隆菌株的DNA作為模板,分別擴增16S rDNA基因片段,將PCR產物經1 % 的瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送往上海生工生物公司進行雙向測序,測序結果拼接后于NCBI網站進行Blast分析,并下載數株同代表菌株相似度高的菌株的16S rDNA序列,與代表菌株一同根據Clustal W方法進行匹配排列,用MEGA 5.0軟件中的 Kimura 2－Parameter Distance模型以neighbourjoining分析法構建得到系統發育樹,并進行 1000次Bootstraps檢驗,最終得到分離菌株的菌屬信息。

1.4 產酶試驗

將分離純化自刺參腸道的 224株細菌,分別點種于蛋白酶選擇培養基、淀粉酶選擇培養基和脂肪酶選擇培養基上,28℃培養48 h。判定方法參照趙斌等[8]和馮雪等[9]。

三種培養基的制備:

蛋白酶選擇培養基: 酪蛋白 10 g,酵母膏 1 g,瓊脂16 g,人工海水1 000 mL;調pH至7.4;121.5 ℃下高溫滅菌20 min。

淀粉酶選擇培養基: 可溶性淀粉10 g,蛋白胨5 g,酵母膏1 g,瓊脂16 g,人工海水1 000 mL;調pH至7.4;121.5 ℃下高溫滅菌20 min。

脂肪酶選擇培養基: 蛋白胨10 g,吐溫–80 10 mL,CaCl2?7H2O 0.1 g,瓊脂 9 g,人工海水 1 000 mL;調pH至7.4;121.5 ℃下高溫滅菌20 min。

1.5 溶血性試驗

將無菌的山羊血平板復溫至25 ℃后,挑選已活化的99株細菌接種于山羊血平板培養基上,于25 ℃恒溫培養箱中培養,48 h后觀察細菌的溶血能力。若菌落周圍出現溶血環,表明該細菌具溶血能力,是潛在的病原菌。若菌落周圍未出現溶血環,表明該細菌無溶血能力。

2 結果

2.1 刺參腸道細菌數量

從 4個處理組的刺參腸道細菌培養平板中選取菌落分布均勻、生長良好、數目在30～300的平板,進行菌落計數,由公式(各組每克樣品細菌數量=(5×10×稀釋倍數×單菌落數平均值)/樣品重量)計算出各組刺參腸道細菌數量(表1)。由表 1可知,實驗各組刺參腸道細菌數量在(2.83～6.39)×107cfu/g,其中養殖和野生刺參腸道內容物中細菌數量均比腸壁中細菌數量高出一倍左右。野生組刺參無論是細菌數量還是檢出的細菌種類都較養殖組刺參高。

表1 各組腸道細菌含量統計(×107cfu/g )Tab.1 Content analysis of gut bacteria in different groups (×107cfu/g )

2.2 刺參腸道細菌組成

統計養殖刺參之腸壁組、內容物組以及野生刺參之腸壁組、內容物組的腸道菌培養平板上的菌落數量,其均值分別為 103、90、151、107。按 20%比例分別對各組培養平板上的菌落隨機取樣,進行分子生物學鑒定。依據鑒定結果,統計每組的菌落中各屬細菌的菌落數量,得出每組的細菌組成比例,結果見表2。對各屬代表菌株構建系統進化樹,見圖1～圖6。由表2可知,弧菌屬與假單胞菌屬為養殖和野生刺參共同的優勢菌。希瓦氏菌是野生刺參的次優勢菌,但在養殖刺參的腸壁中沒有檢測到該菌,只在其腸道內容物中檢出。

2.3 產酶試驗和溶血性試驗

經統計分析可知,224株細菌中,同時具有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的菌株24株;同時產蛋白酶、淀粉酶的菌株45株,同時產淀粉酶、脂肪酶的菌株44株,同時產蛋白酶、脂肪酶的菌株39株;只產蛋白酶的菌株6株,只產脂肪酶的菌株1株,只產淀粉酶的菌株1株。224株細菌中的160株細菌具有產酶能力,所占比例為71.43 %,其中具產蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分別為114株、114株、108株,所占比例分別為50.89 %、50.89 %、48.21 %。

表2 刺參腸道菌群組成比例(%)Tab.2 Proportion of gut bacteria of Apostichopus japonicas (%)

圖1 刺參腸道弧菌代表菌株系統進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of representative strain for Vibrio among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖2 刺參腸道假單胞菌代表菌株系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of representative strain for Pseudomonas among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖3 刺參腸道希瓦氏菌代表菌株系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of representative strain for Shewanella among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖4 刺參腸道嗜瓊脂菌代表菌株系統進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of representative strain for Agarivorans among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖5 刺參腸道氣單胞菌代表菌株系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of representative strain for Aeromonas among gut bacteria of Apostichopus japonicus

圖6 刺參腸道芽孢桿菌代表菌株系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of representative strain for Bacillus among gut bacteria of Apostichopus japonicus

溶血性試驗結果顯示,挑選出的99株細菌中有23株具有溶血性,所占比例為23.23 %, 99株細菌中的39株具有產蛋白酶能力,在這39株細菌中共8株具有溶血性,所占比例為20.51 %。

2.4 刺參腸道潛在益生菌菌株的確定

綜合分析試驗數據,確定了 6株細菌作為刺參腸道潛在益生菌,其都來自于野生組刺參之腸壁組,均同時具有蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力,除HS5(Bacillus)菌株外都為本組優勢菌。其菌株信息如表3所示。

表3 刺參腸道潛在益生菌菌株信息Tab.3 Information of intestinal potential probiotic strains of Apostichopus japonicus

3 討論

刺參是我國北方海域最重要的養殖品種之一,尋找安全高效的手段解決刺參養殖中面臨的病害問題,既是突破刺參養殖行業發展瓶頸的關鍵,也具有非常重大的經濟意義和社會效益,益生菌作為替代抗生素及化學藥物防治病害的重要手段,受到了越來越多的重視[3-5]。但目前從刺參腸道及其生活環境中篩選刺參專用高效益生菌的報道極少,而篩選刺參專用益生菌,有必要對刺參腸道微生態作全面的基礎研究。

關于益生菌篩選的方法論有許多,從健康動物腸道中篩選可定植的優勢菌或次優勢菌是篩選益生菌的重要途經[6];在本研究中, 以健康養殖刺參和野生刺參為研究對象,發現試驗各組刺參腸道細菌數量在 2.83×107～ 6.39×107cfu/g,試驗結果與李彬等[10]、孫奕等[11]的結果相當。無論是在細菌數量還是在細菌種類上,野生組刺參都比養殖組刺參高,這與牛宇峰等[12]研究結果相似,而這一現象可能與刺參的習性有關——刺參在自然水域中以底質表層泥沙中的硅藻、海藻碎片、腐殖質、細菌等為食,相比于人工投餌的養殖環境,其攝取細菌的來源比較廣泛。本試驗中發現無論養殖刺參還是野生刺參,其腸道內容物和腸壁第一優勢菌都為弧菌屬,所占比例在50 % 以上,次優勢菌為假單胞菌,而孫奕等[11]僅報道野生刺參腸道內容物中優勢菌群為弧菌屬和假單胞菌屬。此次研究發現野生刺參第三優勢菌為希瓦氏菌,并非牛宇峰等[12]研究結果中的芽孢桿菌。希瓦氏菌為海水中豐度較高的細菌,在很多水生動物腸道內及藻類表面均有發現[13-15],而有研究表明,水域環境對魚類腸道微生物菌群結構具有顯著的影響[16],所以,水域環境的差異可能是造成刺參腸道菌群組成差異的根本原因。

動物腸道中棲居著大量的微生物。從昆蟲到人類的各類動物都缺乏完整的酶系統,均需依靠腸道微生物提供多種酶,才能完成其對食物的消化、營養吸收以及生理代謝等功能,最終達到促生長和增重的作用,因此,從健康動物腸道中篩選具有良好產酶能力的菌株作為益生菌來源的研究也是一個熱點[17-19]。例如,馮雪等[9]探討了草魚和銀鯽腸道菌群的產酶能力,發現草魚和銀鯽腸道內廣泛分布著具有產酶能力的細菌,認為這些細菌分泌的胞外酶和宿主分泌的胞外酶一起參與了食物消化與營養吸收過程。因此對刺參腸道菌群產酶能力的研究有助于我們對刺參營養需求以及腸道益生菌篩選的分析。然而迄今為止,尚未見到關于刺參腸道產消化酶菌群的研究報道。由于蛋白質、淀粉與脂肪為飼料三大營養元素,而植物飼料中往往還具有大量的纖維素,所以一些研究學者將蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及纖維素酶作為分析腸道益生菌的主要依據[19]。于是我們研究分析了刺參腸道菌群關于這四種酶的產酶能力,結果發現刺參腸道中分布著大量產酶菌,并且產蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶菌株比例大致相同。由此推測,刺參對于三大營養成分的需求量應該一致,這就為我們設計刺參飼料配方以及選用飼料酶制劑類相關產品提供了重要的參考依據。在本次研究中沒有檢測到具有產纖維素酶能力的菌株,而馮雪等[9]在草魚腸道內檢出,我們分析,這可能與刺參來源食物中所含纖維素含量較低有關。許多研究表明,不同的物種其腸道內產消化酶細菌的差異,往往與其生理特征及攝食習性有關[17-19]。

研究刺參專用益生菌是為了防治刺參養殖過程中出現的嚴重病害問題,而刺參腸道菌群溶血性與刺參疾病具有深刻的聯系[20-22]。楊嘉龍等[20]從患潰瘍病的養殖刺參的病灶處分離了 1株養殖刺參潰瘍病病原菌,經鑒定為殺鮭氣單胞菌殺日本鮭亞種,并研究其溶血素活性,認為該活性與此菌的致病性有關。研究表明,致病性氣單胞菌和弧菌分泌的胞外蛋白酶和溶血毒素是其主要的致病因子,事實上胞外蛋白酶并不直接致病,但它可將溶血毒素原降解成活性毒素,從而致病[21-22]。因此,具有產溶血素性能作為剔除致病菌和保留益生菌的重要篩選方法,能夠顯著加速益生菌篩選的進程。在本次研究中,我們分析了99株細菌的溶血性,發現病原菌在菌群中所占比例等于具溶血性菌株在菌群中所占比例,如果將同時具有較強產胞外蛋白酶和溶血毒素能力的菌株視作機體病原菌,由此就可推測具溶血性細菌為機體潛在病原菌。將這些菌株視為刺參的潛在致病菌株予以剔除,可以縮小篩選工作量,為下一步進行的潛在益生菌體內篩選工作提供參考。

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