水源水中類固醇雌激素檢測方法研究

賈佳 (浙江環科環境咨詢有限公司,浙江杭州 310007)

張澤華 (浙江工業大學建筑工程學院,浙江杭州 310014)

馬俠,宋崇渭 (浙江環科環境咨詢有限公司,浙江杭州 310007)

水源水中類固醇雌激素檢測方法研究

賈佳 (浙江環科環境咨詢有限公司,浙江杭州 310007)

張澤華 (浙江工業大學建筑工程學院,浙江杭州 310014)

馬俠,宋崇渭 (浙江環科環境咨詢有限公司,浙江杭州 310007)

通過固相萃取-高效液相色譜(SPE-HPLC)聯用的方法建立了水中微量共存類固醇雌激素(Steriod estrogens,SEs)——雌酮(Estrone,E1)、17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)、17α-乙炔基雌二醇(17α-ethynylestradiol, EE2)的同時檢測分析方法。該方法具有操作簡單、重現性好、準確度和精確度高等優點。對浙江省某市主要供水水源及河道景觀用水進行為期一年的檢測,水源水中E1、E2和EE2均有檢出,水源水中E1和EE2檢出率偏低,小于10%,檢出最高濃度分別為56、97ng/L,EE2的存在水平較高;E2的檢出最為頻繁,檢出率超過30%,最低濃度為70ng/L,最高濃度133ng/L;景觀水中3種SEs的含量及檢出頻率均高于水源水,水環境中存在SEs痕量污染。

水源水;類固醇雌激素;雌酮;17β-雌二醇;17α-乙炔基雌二醇;固相萃取;高效液相色譜

類固醇雌激素(SEs)在極其微量(ng/L)的條件下即可對生物等產生很大的雌性化效應,近年來受到研究學者的廣泛關注[1-5]。SEs包括雌酮(E1)、雌二醇(E2)、乙炔基雌二醇(EE2)和雌三醇(E3)等,均為四環分子結構,主要差別在于C-16和C-17位置上的基團種類和空間化學排列的差異。雌二醇根據C-17位羥基指向不同分為17α-雌二醇和17β-雌二醇,后者易被氧化成為雌酮,也可通過水合作用轉化為雌三醇[6]。SEs在水體中的含量普遍較低,以痕量存在,如何快速、準確的實現其定量檢測成為關鍵問題。

下面,筆者采用固相萃取-高效液相色譜法展開了水環境中微量SEs的檢測,并通過該方法對浙江省某市水源水及景觀水進行了為期一年的調查。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1)試劑 雌酮(標準品,≥99.5%,Dr.Ehrenstorfor Gmb H,德國);17α-乙炔基雌二醇(標準品, ≥99.3%,Dr.Ehrenstorfor Gmb H,德國);17β-雌二醇(標準品,≥96.8%,Dr.Ehrenstorfor Gmb H,德國);乙腈(色譜純,99%,CNW,美國);甲醇(色譜純,99%,CNW,美國);混合纖維素酯微孔濾膜(0.45μm,上海興亞凈化材料,上海);超純水(18mΩ,Mili-Q,美國);去離子水(浙江工業大學)。

2)儀器 高效液相色譜儀(Agilent1200,安捷倫,美國)配Eclipse XDB-C18色譜柱(5μm, 46×150mm,美國);12頭固相萃取裝置(CNW,美國);C18固相萃取小柱(500mg,3ml,CNW,美國);12孔氮吹儀(OA-SXS,美國);紫外可見分光光度計(heliosγ,SPR-200-510U,Thermo);玻璃砂芯過濾裝置(浙江工業大學)。

1.2 試驗方法

3種類固醇雌激素E1、E2、EE2分別溶解于10ml甲醇中,制備試驗儲備液。采用超純水稀釋儲備液,配制成1g/L的SEs使用液,4℃密封保存。采用超純水稀釋,分別配制成濃度為0.5、1、2、5、7、10mg/L的系列標準樣品,繪制SEs定量標準曲線。

固相萃取條件為10ml甲醇和10ml超純水進行固相萃取小柱活化,流速2ml/min,以5ml/min的速度過水樣,萃取結束后分別采用超純水及10%的甲醇水溶液淋洗固相萃取柱,4ml甲醇洗脫,氮吹后定容為1ml,進行液相色譜分析,如需保存樣品,則于-20℃保存。

分別取1L純水、自來水與水源水經0.45μm混合纖維素酯微孔濾膜過濾后投加適量雌激素使用液,分別配制成2.5μg/L和10μg/L的雌激素加標溶液,進行加標試驗,考察方法檢測限與精確度。試驗用水的水質如表1所示。

表1 試驗用水的水質

2 液相色譜檢測條件

3種SEs結構相近,相對分子質量分別為E1(270.4)、E2(272.4)和EE2(296.4),且結構類似,試驗中選取E2作為典型物質進行紫外光吸收測試試驗。配制一定濃度的E2水溶液,紫外分光光度計下進行吸光度掃描確定物質吸光波長,結果如圖1所示。從圖1中可知,SEs在220 nm和280nm波長紫外光線照射下有強烈的紫外光吸收,這是因為其結構中含有—OH、C==C等吸光基團的作用。且類固醇雌激素在220nm下吸收效果優于280nm波長紫外光下的吸收。由于液相色譜通常采用溶劑甲醇和乙腈等作為流動相,這2中溶劑在紫外光下的截止波長分別為205nm和190nm,對類固醇雌激素的紫外光吸收不構成影響,故而在液相色譜檢測中選用吸收波峰較大的220nm作為液相檢測波長。

圖1 190～900nm波長下雌激素吸光度

圖2 3種類固醇雌激素液相色譜圖

將配制好的3種SEs標準品分別液相進樣,調節液相色譜要求目標物出現較好峰型,液相色譜條件為:流動相乙腈和水,比例50∶50,流速0.7ml/min,檢測波長220nm,進樣體積0.02μl,三者出現較好峰型如圖2所示。3種SEs的出峰順序為E2、EE2和E1,保留時間分別為4.9、6.0和7.0min,標準曲線分別為:

3 洗脫體積對固相萃取技術的影響

用純水分別配制1L含E1、E2、EE2濃度為10μg/L和2.5μg/L的混合標準水溶液,固相萃取柱富集后,分別以1ml甲醇6次洗脫固相萃取小柱,液相進樣檢測洗脫的類固醇雌激素濃度,結果如表2所示。從表2中可知,甲醇洗脫固相萃取小柱吸附的類固醇雌激素主要集中于前面的2ml溶劑,從3～6ml甲醇洗脫開液中均未能檢出類固醇雌激素,考慮到洗脫效果及試驗耗時,試驗中洗脫取4ml。

表2 洗脫體積對類固醇雌激素檢出濃度的影響

4 加標回收率及方法精密度

選用之前確定的固相萃取條件和液相檢測條件,進行加標試驗,加標回收率結果如圖3所示。由圖3可見,純水中固相萃取加標回收2.5μg/L的E2、EE2和E1的回收率分別為110.2%、96.9%和112.9%,原始濃度為10μg/L時E2、EE2和E1的回收率分別為93.6%、96.9%和94.1%,不同初始濃度均進行多次平行測定,結果標準偏差0.21%～5.44%。當以自來水及水源水為背景時,3種類固醇雌激素加標回收率也比較高,均位于86.8%～103.6%范圍內,標準偏差均小于5.30,可見固相萃取可準確測定水環境中微量雌激素,符合方法測定要求。

精密度測試采用7個超純水加標(10μg/L)樣品進行平行測定,計算3種類固醇雌激素的含量及其標準偏差(SD)、相對標準偏差(RSD),結果如表3所示。由表3可見,固相萃取方法測定3種類固醇雌激素的RSD在0.65%～2.05%,控制在了U.S.EPA552.3方法規定的檢測限的臨界值20%以內,符合測定要求。

圖3 加標回收率試驗結果

表3 超純水加標(10μg/L)樣品中類固醇雌激素的檢測結果(n=7)

5 實際應用

調查水樣取自浙江省某市市區4個凈水廠的進水水樣,分別標注為1,2,3和4#,同時在市區景觀河取水5#進行對比。

采用4L棕色玻璃瓶采集水樣,取1L水樣先用50目篩網過濾,后用玻璃砂芯濾斗經0.45μm濾膜過濾后24h內固相萃取預處理,并立即進行液相色譜檢測,如不能立即檢測則-4℃保存,并盡快預處理,水質及3種類固醇雌激素的含量如圖4和圖5所示。

一年調查期內,該市水源水水體p H 7.53～7.64,溶解氧6.50～6.65mg/L,高錳酸鹽指數為2.97～3.26mg/L,氨氮0.69～1.4mg/L,總磷0.08～0.09mg/L,總氮1.99～3.99mg/L。根據《地表水環境質量標準》(GB 3838-2002),從高錳酸鹽指數判斷水源水基本符合Ⅱ、Ⅲ類水質標準,但從氮磷的角度分析,水源水質偏差,處于富營養化狀態。

景觀水體質量相對水源水略差,p H值7.48～7.51,溶解氧為5.93～5.80mg/L,高錳酸鹽指數為3.81～4.30mg/L,氨氮為1.81～2.32mg/L,總磷為0.10～0.12mg/L。水中氨氮偏高,處于劣Ⅴ水平。

調查數據表明,水源水中E1和EE2檢出率偏低,小于10%,檢出最高濃度分別為56、97ng/L,EE2的存在水平較高;E2的檢出最為頻繁,檢出率超過30%,最低濃度為70ng/L,最高濃度133ng/L。景觀水體中3種雌激素的含量檢出率及檢出濃度均高于水源水,檢出率基本超過50%,E2 為100%。E1含量28～50ng/L,EE2含量74～99ng/L,E2含量60～101ng/L,這可能是由于景觀處于居民鬧市區,受周邊生活居民影響,且水流速度過慢易于污染物富集所致。

圖4 調查水源3種類固醇雌激素含量分析

圖5 調查水源常規水質分析

6 結語

固相萃取-液相色譜法同時檢測水環境中微量存在的3種類固醇雌激素,回收率可達90%以上,方法重現性好,準確度高,適合大批量樣品的分析。

[1]Sun Y,Huang H,Sun Y,Wang C,et al.Ecological risk of estrogenic endocrine disrupting chemicals in sewage plant effluent and reclaimed water[J].Environmental Pollution,2013,180:339-344.

[2]Sales L B,Kamstra J H,Cenijn P H,et al.Effects of endocrine disrupting chemicals on in vitro global DNA methylation and adipocyte differentiation[J].Toxicology in Vitro,2013,27(6):1634-1643.

[3]Qiang Z M,Dong H Y,Zhu B Y,et al.A comparison of various rural wastewater treatment processes for the removal of endocrinedisrupting chemicals(EDCs)[J].Chemosphere,2013,92(8):986-992.

[4]Esteban S,Gorga M,Petrovic M,et al.Analysis and occurrence of endocrine-disrupting compounds and estrogenic activity in the surface waters of Central Spain[J].Science of The Total Environment,2014,466-467:939-951.

[5]李青松,高乃云,馬曉雁,等.水處理工藝中甾體雌激素的去除及控制研究進展[J].水處理技術,2011,37(9):19-23.

[6]吳明紅,任來堂,徐剛,等.甾體雌激素的污染水平及轉化機制[J].自然雜志,2010,32(2):76-79.

[編輯]洪云飛

X703;TU99

A

1673-1409(2014)19-0023-04

2014-02-05

浙江省自然科學基金資助項目(LQ12E08013);江蘇省環境科學與工程重點實驗室開放基金資助項目(Zd131202);浙江省環境科學與工程重中之重學科開放基金資助項目(20130307)。

賈佳(1981-),女,碩士,工程師,現主要從事環境影響評價及環境咨詢方面的研究工作。