甲醛降解菌的篩選及其生物特征研究

鄒征強(qiáng)，王冬冬，趙小玉，劉陽松，胡勇，張婭

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

甲醛降解菌的篩選及其生物特征研究

鄒征強(qiáng)，王冬冬，趙小玉，劉陽松，胡勇，張婭

(重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054)

從花溪河流污泥中篩選分離出一株甲醛降解菌，對(duì)其生長特性及甲醛降解特性進(jìn)行了初步研究，得出該菌株的最適條件是:溫度為30～40℃，pH值為6～8。在最適生長條件下，該菌株對(duì)甲醛的耐受濃度可達(dá)2 g/L，84 h內(nèi)可將91.9%的甲醛降解。菌懸液超聲破碎上清液能使溶液中甲醛濃度降低，由此推測菌株可能是通過分泌一種酶來降解甲醛的。

甲醛;篩選;降解菌

甲醛是一種無色、具有強(qiáng)烈刺激性的有毒氣體。在我國有毒化學(xué)品優(yōu)先控制名單上甲醛高居第二位，已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織確定為致癌和致畸性物質(zhì)，是公認(rèn)的變態(tài)反應(yīng)源，也是潛在的強(qiáng)致突變物之一，具有強(qiáng)烈的致癌和促癌作用［1－2］。甲醛性質(zhì)活躍，能發(fā)生氧化、還原、加成、聚合等反應(yīng)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后會(huì)對(duì)呼吸道產(chǎn)生嚴(yán)重的刺激，引起水腫、眼刺痛、頭痛，也可引發(fā)支氣管哮喘［3－4］。體積分?jǐn)?shù)為35%～40%的甲醛水溶液通稱福爾馬林，常用于實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的保存。在家具的制作、墻面、地面裝飾鋪設(shè)所使用的粘合劑中含有大量甲醛［5］。在化工等行業(yè)甲醛也具有重要作用。由于甲醛的廣泛應(yīng)用性和我們環(huán)保意識(shí)的薄弱，其已對(duì)我們的居住環(huán)境造成極大的破壞，嚴(yán)重危害人的身體健康。因此，如何消除環(huán)境中的甲醛污染十分必要。

目前，治理甲醛污染的方法主要有化學(xué)反應(yīng)方法、物理吸附技術(shù)、臭氧負(fù)離子技術(shù)、納米光催化技術(shù)、低溫等離子技術(shù)、植物凈化和微生物降解等方法［6］。其中微生物降解具有高效、低成本和無二次污染的特點(diǎn)，已得到環(huán)保人士的廣泛認(rèn)同。微生物降解甲醛的關(guān)鍵是要獲得能高效降甲醛的菌株。黃賽花等［7］報(bào)道篩選獲得了1株甲醛降解真菌黃曲霉Aspergillus spp.H4，該真菌在培養(yǎng)144 h內(nèi)能使甲醛從1 241 mg/L下降到4 mg/L;Doronina等［8］研究的一株P(guān).alcaligenes培養(yǎng)3 d后降解甲醛的能力達(dá)2 000 mg/L;Saeed等［9］報(bào)道的4株P(guān).pseudoalcaligenes(LSW，SSW，NSW，OSS)降解甲醛的能力達(dá)1 850 mg/L。現(xiàn)階段分離篩選到有實(shí)際利用價(jià)值的甲醛降解菌株的報(bào)道還很少，本研究試圖篩選分離出能高效降解甲醛的菌株，為利用微生物降解甲醛提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

從重慶理工大學(xué)花溪河下水道出口采集污泥，從中分離篩選得到能夠以甲醛為唯一碳源的菌株，命名為菌株Z。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基的配置

富集培養(yǎng)基:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，蒸餾水1 000 mL，pH值為7.4～7.6。

固體培養(yǎng)基:在富集培養(yǎng)基中加入20 g/L瓊脂粉。

選擇培養(yǎng)基:K2HPO40.5 g，NaNO31 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，KCl 0.5 g，瓊脂20 g甲醛(2 mg/mL)，蒸餾水1 000 mL，pH=6。

上述所有培養(yǎng)基都于121℃高壓蒸氣滅菌30 min。

1.2.2 試劑

乙酰丙酮溶液［10］:50 g乙酸銨、6 mL冰乙酸及0.5 mL乙酰丙酮試劑溶于100 mL水中。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甲醛降解菌的篩選

1)將10 g土壤樣品置于100 mL無菌生理鹽水中，振蕩10 min后靜置，取10 mL上清液置于盛有100 mL富集培養(yǎng)基的錐形瓶中，然后加入200 μL甲醛(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為37%～40%)，在150 r/min、30℃搖床上富集培養(yǎng)24 h，得富集培養(yǎng)菌懸液。

2)取適量菌懸液接種于裝有10 mL基本培養(yǎng)基試管中，加入25 μL甲醛，置于150 r/min、30℃搖床上培養(yǎng)24 h，取培養(yǎng)24 h后的菌液接種于甲醛初始濃度為0.5 mg/mL的基本培養(yǎng)基中，在搖床上震蕩培養(yǎng)。此后不斷提高基本培養(yǎng)基中甲醛含量，并接種前次馴化的菌液，直至菌株不再繼續(xù)生長［11］。

3)將甲醛含量最大的富集菌液連續(xù)10倍梯度稀釋，取各稀釋液0.2 mL分別接種至選擇培養(yǎng)基，30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，選取生長較好的菌落，并不斷進(jìn)行分離純化，直至得到純菌株，以保證菌株的高純度及降解性的穩(wěn)定。

1.3.2 菌株Z最適生長條件的研究

1)耐鹽性

配置不同氯化鈉濃度梯度(2%、4%、6%、8%、10%)的富集培養(yǎng)基，每個(gè)梯度設(shè)置3個(gè)平行，接種菌液，搖床上振蕩培養(yǎng)48 h，測OD。

2)最適溫度

分別設(shè)定20℃、30℃、40℃、50℃4個(gè)溫度，每個(gè)溫度設(shè)置3個(gè)平行，接種菌液，搖床上振蕩培養(yǎng)48 h，測OD。

3)最適pH值

培養(yǎng)基pH值分別設(shè)定為5、6、7、8、9，每組設(shè)置3個(gè)平行，接種菌液，搖床上35℃振蕩培養(yǎng)48 h，測OD。

1.3.3 菌株Z的形態(tài)、生化特征

將其劃線接種于基本培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2 d后觀察菌落形態(tài)特征;取培養(yǎng)20 h的菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在油鏡下觀察菌株形態(tài)特征;糖發(fā)酵，淀粉、油脂和明膠水解實(shí)驗(yàn)按照文獻(xiàn)［12］進(jìn)行。

1.3.4 生長曲線的測定

將菌株Z接種在配有基本培養(yǎng)基的錐形瓶中，并在培養(yǎng)基中加入適量甲醛，同時(shí)設(shè)置不接菌的作為對(duì)照組，以便于測量甲醛揮發(fā)量。將錐形瓶置于35℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)，每隔一段時(shí)間取樣一次，然后運(yùn)用分光光度計(jì)測定樣品菌體的光密度值(OD 600 nm)［13］。100 h后根據(jù)OD值繪制出細(xì)菌的生長曲線。

1.3.5 甲醛降解率的測定

將加有200 mL基本培養(yǎng)基的錐形瓶滅菌后加入1 000 μL甲醛，此時(shí)甲醛濃度約為2 mg/mL，接入菌株Z做為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)將不接菌的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將兩組錐形瓶放置于35℃、150 r/min的搖床上振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣一次。取樣后先將樣品離心5 min(5 000 r/min)，再取上清液稀釋，加入適量乙酰丙酮溶液于60℃恒溫水浴下反應(yīng)10 min，最后用分光光度計(jì)測定OD(412 nm)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出甲醛濃度，繪制出甲醛降解曲線。

1.3.6 甲醛降解機(jī)制

為了確定細(xì)菌是非特異性與甲醛結(jié)合還是分泌某種酶來降解甲醛［14］，設(shè)計(jì)了以下實(shí)驗(yàn):將菌株Z接種至選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，超聲波破碎、離心后，取上清液;將上清液加入含甲醛(1.5 mg/ mL)的溶液中，將其置于35℃的培養(yǎng)箱中，設(shè)置空白對(duì)照;分別在0、4、8、12 h定時(shí)取樣，用乙酰丙酮法測定樣品的OD值(412 nm)，檢測溶液中甲醛濃度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 甲醛降解菌的篩選純化結(jié)果

應(yīng)用平板劃線法和系列稀釋法從河流下水道污泥中分離篩選得到一株能以甲醛為唯一碳源的降解菌，即菌株Z。菌落形態(tài)如圖1所示。菌落表面呈粘液樣，光滑、凸起，大多呈完整的圓形;外觀呈乳白色、有光澤，培養(yǎng)3天后菌落表面有2圈黃色物質(zhì)生成。菌株Z為革蘭氏染色結(jié)果為陰性，形態(tài)為短桿狀。

圖1 菌株Z菌落形態(tài)

2.2 生化特征

對(duì)菌株Z進(jìn)行的生化特征測定，結(jié)果見表1。

表1 降解菌生化特征測定

2.3 最適生長條件

通過試驗(yàn)，菌株Z的最適生長溫度為30～35℃，最適為pH值為6～8，NaCl濃度超過8%時(shí)，細(xì)菌不生長。

2.4 細(xì)菌生長曲線的測定結(jié)果

利用分光光度計(jì)測得降解菌生長曲線結(jié)果見圖2。由生長曲線可以看出:0～12 h為延滯期，此時(shí)細(xì)菌主要的主要任務(wù)是使代謝系統(tǒng)適應(yīng)環(huán)境的需要;12～60 h為對(duì)數(shù)期，此時(shí)生長最快;60～80 h細(xì)菌進(jìn)入穩(wěn)定期;80 h后光密度值(OD 600 nm)有所增大，即細(xì)菌密度略有所增加，有可能出現(xiàn)二次生長的跡象。

圖2 菌株Z生長曲線

2.5 甲醛降解率的測定結(jié)果

用分光光度計(jì)測定OD值，繪制甲醛降解曲線，結(jié)果見圖3。由圖3可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，甲醛降解率逐漸增大，84 h后，降解效率為91.9%，說明細(xì)菌對(duì)甲醛有良好的降解效果。在25～35 h內(nèi)，細(xì)菌對(duì)甲醛的降解速率最快，與圖3生長曲線相比較，此時(shí)細(xì)菌處于對(duì)數(shù)生長期，說明細(xì)菌在生長期需大量利用甲醛來供其生長繁殖。

圖3 甲醛降解曲線

2.6 細(xì)菌降解甲醛機(jī)制

菌株降解甲醛機(jī)制的研究結(jié)果見圖4。由圖4可知，空白組吸光度幾乎不變，而實(shí)驗(yàn)組吸光度明顯降低，說明降解菌并不是非特異性地將甲醛吸附于菌體表面，而是釋放了某種內(nèi)源性或外源性物質(zhì)來降解利用甲醛，繼而使培養(yǎng)基甲醛濃度降低。

圖4 細(xì)菌分泌酶降解甲醛曲線

3 結(jié)論

從河流下水道污泥篩選出一株能降解甲醛的細(xì)菌，該菌株為革蘭氏陰性短桿菌，能高耐甲醛并以甲醛為唯一碳源。其最適生長溫度為30～40℃，最適pH為6～8。細(xì)菌通過合成某種內(nèi)源性或者外源性物質(zhì)來降解甲醛。當(dāng)在以甲醛為唯一碳源時(shí)，其降解效率為91.9%，能將甲醛降解到0.05 mg/mL以下。更為重要的是，對(duì)其降解機(jī)制的初步研究，結(jié)果表明菌株Z通過釋放某種酶來降解甲醛。

利用微生物來降解甲醛，不但能高效地去除甲醛，而且不會(huì)造成二次污染，環(huán)保節(jié)能，是治理甲醛污染的有效途徑，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

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(責(zé)任編輯 何杰玲)

Isolation and Biological Characteristic of Bacterial Strain Capable to Metabolize Formaldehyde

ZOU Zheng－qiang，WANG Dong－dong，ZHAO Xiao－yu，
LIU Yang－song，HU Yong，ZHANG Ya
(School of Pharmacy and Bioengineering，Chongqing University of Technology，Chongqing 400054，China)

One biological strain capable to degrade and metabolize formaldehyde was isolated from the sludge of Huaxi river.Meanwhile，the growth characteristics and formaldehyde degradation characteristics of the strains were preliminarily studied.The optimal condition of growth was determined as the follows:incubation temperature of 30～40℃and pH value of 6～8.In optimal conditions，the tolerance to formaldehyde concentration of the strain up to 2 g/L，and the removal efficiency of formaldehyde can be as high as 91.9%in 84h.The formaldehyde concentration in the solution can be reduced by the supernate of ultrasound broken bacteria，which suggests the strain may degrade formaldehyde by secreting an enzyme.

formaldehyde;screening;degrading bacteria

Q93

A

1674－8425(2014)03－0077－04

10.3969/j.issn.1674－8425(z).2014.03.014

2013－09－20

重慶理工大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)學(xué)科資助項(xiàng)目(0110121221－30277)

鄒征強(qiáng)(1990—)，男，江西人，主要從事微生物與生化藥學(xué)方面研究;通訊作者胡勇(1970—)，男，四川人，副教授，主要從事微生物與生化藥學(xué)方面研究。

鄒征強(qiáng)，王冬冬，趙小玉，等.甲醛降解菌的篩選及其生物特征研究［J］.重慶理工大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2014(3):77－80.

format:ZOU Zheng－qiang，WANG Dong－dong，ZHAO Xiao－yu，et al.Isolation and Biological Characteristic of Bacterial Strain Capable to Metabolize Formaldehyde［J］.Journal of Chongqing University of Technology: Natural Science，2014(3):77－80.