不同濃度dbcAMP對SH-SY5Y細胞向γ-氨基丁酸能神經元分化潛能的影響

王登莉,周 莉,于 升,吳 江,趙 慧

(1.吉林大學基礎醫學院組織學與胚胎學系,吉林長春 130021;2.吉林大學第一醫院神經內科,吉林長春 130021)

不同濃度dbcAMP對SH-SY5Y細胞向γ-氨基丁酸能神經元分化潛能的影響

王登莉1,周 莉1,于 升1,吳 江2,趙 慧1

(1.吉林大學基礎醫學院組織學與胚胎學系,吉林長春 130021;2.吉林大學第一醫院神經內科,吉林長春 130021)

目的:建立具有分化成γ-氨基丁酸能神經元潛能的神經干細胞模型,為γ-氨基丁酸能神經元退行性疾病的研究提供適宜的研究載體。方法:應用雙丁酰環腺苷酸(dbc AMP)誘導人神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y細胞),分為0 mmol·L－1dbc AMP組(對照組)和0.3、0.6、1.0及2.0 dbc AMP組,觀察誘導后各組SH-SY5Y細胞的形態變化;采用Imge-Pro Plus 5.0軟件測量神經元樣細胞神經突起長度,計算神經突起＞30μm細胞所占細胞總數的百分率;采用免疫熒光細胞化學技術檢測γ-氨基丁酸能神經元標志性蛋白——谷氨酸脫羧酶65 (GAD65)的表達,并計算其免疫反應陽性率。結果:形態學觀察,對照組SH-SY5Y細胞呈多邊形、圓形或梭型,胞膜光滑,邊界清晰;各濃度dbc AMP組隨著dbc AMP濃度的增加和誘導時間的延長,SH-SY5Y細胞胞體變小、突起變長;1.0 mmol·L－1dbc AMP組細胞互相交織,表現出成熟神經元的表型。SH-SY5Y細胞誘導培養72 h后,與對照組(31.4%±4.2%)比較,0.3、0.6、1.0和2.0 dbc AMP組神經突起＞30μm細胞所占細胞總數的百分率(40.1%±5.7%、47.5%±6.2%、73.1%±3.2%和74.3%±6.1%)明顯升高(P＜0.05或P＜0.01)。SH-SY5Y細胞誘導培養72 h后,與對照組(10.2%±2.1%)比較,0.3、0.6、1.0和2.0 dbc AMP組GAD65陽性細胞表達率(22.1%±2.4%、46.9%±3.2%、70.7%±3.4%和72.3%±3.7%)明顯升高(P＜0.05 或P＜0.01)。結論:SH-SY5Y細胞具有分化為γ-氨基丁酸能神經元樣細胞的潛能,1.0 mmol·L－1是dbc AMP的最佳誘導濃度。

雙丁酰環磷腺苷;人神經母細胞瘤細胞;誘導;分化

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器SH-SY5Y細胞購自美國典型培養物細胞庫(American Type Culture Collection,ATCC)。小鼠抗人谷氨酸脫羧酶65 (GAD65)單克隆抗體購自Santa Cruz公司,驢抗小鼠Alexa Fluor 488和DAPI購自美國Invitrogen公司,dbc AMP購自美國Sigma公司,低糖DMEM培養基購自美國Gibco公司,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)購自杭州四季青生物工程公司,胰蛋白酶購自北京鼎國生物技術有限責任公司。熒光倒置相差顯微鏡為日本Olympus公司產品(IX71),CO2培養箱為日本Sanyo公司產品(MCO-175),超凈工作臺為蘇凈集團安泰公司產品(SW-CJ-1F)。

1.2 細胞傳代培養SH-SY5Y細胞采用含10% FBS、60 mg·L－1青霉素及100 mg·L－1鏈霉素的低糖DMEM培養液,在5%CO2、37℃飽和濕度孵箱中培養。待細胞長到90%融合時,用0.25%的胰蛋白酶消化,以1∶3或1∶4傳代,取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 細胞分組和誘導將SH-SY5Y細胞按1× 104/孔的密度接種于放置了蓋玻片的24孔培養板中。為了減少FBS對dbc AMP誘導分化作用的干擾,在誘導實驗中將培養基中FBS的濃度降低為0.5%。細胞共分為5組,每組設3個復孔,均用含0.5%FBS的低糖DMEM培養基培養,包括0 mmol·L－1dbc AMP組(對照組)和0.3、0.6、1.0及2.0 mmol·L－1dbc AMP組,將24孔培養板置于37℃、體積分數為5%CO2培養箱中培養,每天于倒置相差顯微鏡下觀察細胞的生長情況并拍照。dbc AMP誘導72 h后,取出細胞爬片進行免疫熒光細胞化學染色。

1.4 神經細胞突起長度測量神經元樣細胞神經突起長度的測量方法參照文獻[7-8]。以細胞核中心為測量起點,突起末端為終點,使用Image-Pro Plus 6.0軟件測量神經突長度,長度＜30μm的突起忽略不計。根據各視野下標尺的測量長度,計算各神經突起的實際長度,并計算出各組細胞神經突起的平均長度。

1.5 免疫熒光細胞化學染色和免疫陽性細胞計數將各組細胞用冷丙酮固定后,0.01 mol·L－1PBS(p H 7.2)沖洗細胞;5%驢血清室溫封閉30 min,滴加小鼠抗人GAD65單克隆抗體(效價1∶25)于4℃孵育過夜(陰性對照組用PBS代替GAD65一抗);0.01 mol·L－1PBS沖洗后,避光滴加熒光標記的驢抗小鼠Alexa Fluor 488抗體(效價1∶500),于37℃孵育50 min;0.01 mol·L－1PBS沖洗,DAPI(工作濃度為1 mg·L－1)滴染細胞核5 min,0.01 mol·L－1PBS沖洗;甘油磷酸緩沖液封片后熒光顯微鏡觀察、拍照并計數。20倍物鏡下,每個樣品隨機選取10個視野,分別計算每個視野下的GAD65免疫反應陽性細胞數。

1.6 統計學分析應用SPSS 13.0軟件進行統計學處理。各組細胞神經突起的長度和神經突起＞30μm細胞數的百分率以±s表示,組間比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 dbc AMP誘導后SH-SY5Y細胞形態學對照組SH-SY5Y細胞培養48或72 h時細胞呈多邊形、圓形或梭型,胞膜光滑,邊界清晰。各濃度dbc AMP組細胞培養24 h時可見細胞形態發生改變,細胞兩端開始伸出短小的樹突樣突起。48 h 時0.3 mmol·L－1dbc AMP組只有少數短突起; 0.6 mmol·L－1dbc AMP組突起增多但突起較短,突起交織現象少;1.0 mmol·L－1dbc AMP組細胞兩端出現長而細的軸突樣突起,并相互交織連接。隨著dbc AMP誘導時間的延長,各濃度dbc AMP組細胞形態變化均很明顯,誘導72 h時1.0 mmol·L－1dbc AMP組越來越多的細胞突起變長,細胞相互交織現象更明顯,表現出成熟神經元的表型,且細胞的平均神經突起長度也隨著dbc AMP濃度的增加而變長。見圖1。

在誘導72 h時,1.0 mmol·L－1dbc AMP組突起＞30μm的細胞數占細胞總數的(73.1± 3.2)%,與對照組[(31.4±4.2)%]比較差異有統計學意義(P＜0.01);神經突起平均長度為(98.37±4.57)μm,與對照組[(41.77±4.58)μm]比較差異有統計學意義(P＜0.01)(表1)。2.0 mmol·L－1dbc AMP組神經突起平均長度增加,達到(112.86±5.25)μm,突起＞30μm的細胞所占比例為(74.3±6.1)%,與1.0 mmol·L－1dbc AMP組比較無明顯變化(P＞0.05)(表2),并且同一放大倍數視野下細胞總數減少。group;E,F:0.6 mmol·L－1dbc AMP group;G,H:1.0 mmol·L－1dbc AMP group;I,J:2.0 mmol·L－1dbc AMP group.“→”:Long neurites after dbc AMP induction;Bar＝50μm.

圖1 各組SH-SY5Y細胞形態學Fig.1 Morphology of SH-SY5Y cells in various groupsA,C,E,G,I:48 h after dbc AMP treatment;B,D,F,H,J:72 h after dbc AMP treatment;A,B:Control group;C,D:0.3 mmol·L－1dbc AMP

表1 各組SH-SY5Y細胞神經突起的平均長度Tab.1 Average lengths of neurites of SH-SY5Y cells in various groups(n＝3,±s,l/μm)

表1 各組SH-SY5Y細胞神經突起的平均長度Tab.1 Average lengths of neurites of SH-SY5Y cells in various groups(n＝3,±s,l/μm)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs control group.

Group Average length of neurite (t/h) 48 72 Control 41.43±4.66 41.77±4.58 dbc AMP(mmol·L－1) 0.3 53.61±6.91?70.11±6.26?0.6 70.17±7.25?80.61±7.10?1.0 84.02±7.83??98.37±7.83??2.0 104.53±8.22??112.86±8.50??

表2 各組神經突起＞30μm細胞占總細胞數的百分率Tab.2 Percentages of cells with neurites longer than 30μm in various groups(n＝3,±s,η/%)

表2 各組神經突起＞30μm細胞占總細胞數的百分率Tab.2 Percentages of cells with neurites longer than 30μm in various groups(n＝3,±s,η/%)

?P＜0.05,??P＜0.01 vs control group.

Group Percentage of cells with neurites＞30μm (t/h) 48 72 Control 10.32±3.56 31.46±4.22 dbc AMP(mmol·L－1) 0.3 37.23±4.79?40.17±5.77?0.6 42.72±4.44?45.53±6.23?1.0 62.46±3.44??73.16±3.22??2.0 72.64±5.77??74.33±6.11??

2.2 免疫熒光細胞化學染色及免疫陽性細胞計數

通過免疫熒光細胞化學染色鑒定γ-氨基丁酸能神經元的標志物GAD65的表達,陽性產物被熒光標記的抗體染成綠色,分布在細胞膜上,而陰性對照(即2.0 mmol·L－1dbc AMP組染色過程中未加GAD65一抗)僅有細胞核被DAPI染成藍色,細胞膜上無特異性染色。0.3 mmol·L－1dbc AMP 組GAD65陽性細胞數量少,陽性率為(22.1± 2.40)%;0.6 mmol·L－1dbc AMP組GAD65陽性細胞數增多,陽性率達到(46.9±3.2)%; 1.0 mmol·L－1dbc AMP組陽性細胞率高達(70.7±3.4)%,與對照組[(10.2±2.1)%]比較差異有統計學意義(P＜0.01);2.0 mmol·L－1dbc AMP組GAD65陽性細胞率為(72.3± 3.7)%,與1.0 mmol·L－1dbc AMP組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖2(插頁一)。

3 討論

γ-氨基丁酸能神經元是人類大腦發生過程中基本神經元類型,包括抑制性神經元和興奮性神經元,前者屬中間神經元,釋放抑制性神經遞質γ-氨基丁酸,參與形成局部抑制回路[9]。在胚胎神經干細胞和成體神經干細胞體外培養時,如果只加入血清不加入任何其他誘導因素,神經干細胞分化的神經元均為γ-氨基丁酸能神經元,該現象提示γ-氨基丁酸能神經元是神經干細胞自然分化的產物。本實驗選擇的分化誘導劑為細胞本身就存在的第二信使c AMP的衍生物dbc AMP,檢測細胞分化的標志性蛋白為γ-氨基丁酸能神經元產生γ-氨基丁酸的限速酶GAD65,以此探討SH-SY5Y細胞系是否具有神經干細胞特性和能否成為人神經干細胞模型。

由于SH-SY5Y細胞能夠在體外長期培養,通過誘導分化可使細胞形態接近成熟神經元,在實驗中提供穩定的細胞數,具有許多神經元的生化和生理特征而被作為實驗性神經科學研究的神經元細胞模型[10]。SH-SY5Y細胞形態學改變是其細胞分化的表性特征,形態學的成熟程度是判斷分化誘導成功與否的重要標志。細胞形態分化成熟的標準為有1個或1個以上的突起長度延伸至胞體直徑2倍以上[11];神經元細胞的神經突起長度的測量方法參照Neumann等[7]和Li等[8]的報道,長度＜30μm的突起忽略不計。本研究結合這2種標準,較為準確地對分化后的細胞進行了系統的測量。本實驗結果表明:一定濃度dbc AMP可誘導SH-SY5Y細胞形態發生明顯的改變,隨著誘導劑濃度的逐漸增加,SH-SY5Y細胞從最初的多邊形、圓形或梭型逐漸演變為有較長細胞突起的形態,這些突起逐漸伸長并相互交織成網,最長的突起可達120μm,約為細胞體直徑的6倍。Dodurga等[12]發現: SH-SY5Y細胞在10 mmol·L－1RA誘導第3天出現神經突起,并隨著誘導時間的延長,神經突起隨之變長,呈現出神經元表型。上述結果表明SH-SY5Y細胞在一定誘導條件下具有分化為神經元樣細胞的潛能。

誘導劑的種類、濃度及作用時間是成功誘導分化干細胞的重要因素。c AMP是細胞內第2信使,其不僅在調節新陳代謝過程中起到很重要的作用,而且能夠改變細胞形態,影響細胞分化。體外實驗中,c AMP衍生物dbc AMP可以滲透到細胞內,提高細胞內c AMP水平,從而模擬體內某種刺激,所以本實驗選擇dbc AMP為SH-SY5Y細胞分化的誘導劑[13]。本研究結果顯示:經不同濃度dbc AMP處理后,光學顯微鏡下可見SH-5Y5Y細胞形態發生顯著變化,細胞喪失了未分化的腫瘤細胞形態;當dbc AMP濃度為1.0 mmol·L－1時,細胞胞體明顯變小,而且伸出長突起,具有類似神經元的形態;而0.3和0.6 mmol·L－1dbc AMP作用下胞體未見明顯變化。

2.0 mmol·L－1dbc AMP誘導下,SH-SY5Y細胞神經突起長度及GAD65陽性細胞率與1.0 mmol·L－1dbc AMP組比較無明顯改變,并且細胞總數減少,說明高濃度dbc AMP對細胞生長有毒副作用。因此本研究最終確定1.0 mmol·L－1是dbc AMP的最佳誘導濃度。

γ-氨基丁酸能神經元標志性蛋白GAD有2種同工酶,根據其相對分子質量的不同分為GAD65 和GAD67。在神經系統中,GAD65和GAD67通常存在于相同的γ-氨基丁酸能神經元內,但分別由不同的基因編碼,在含量和亞細胞分布上存在差異[14]。本研究采用GAD65標記γ-氨基丁酸能神經元,通過免疫熒光細胞化學染色,熒光顯微鏡下可見GAD65表達部位位于細胞膜上。

綜上所述,SH-SY5Y細胞能夠成為人神經干細胞模型,其具有神經干細胞特性,在一定條件下可分化為γ-氨基丁酸能神經元。本實驗結果為探討胚胎神經干細胞定向分化的分子機制提供了適宜的研究載體。

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Influence of different concentrations of dbc AMP in differentiation potentiality of SH-SY5Y cells to GABAergic-like cells

WANG Deng-li1,ZHOU Li1,YU Sheng1,WU Jiang2,ZHAO Hui1
(1.Department of Histology and Embryology,School of Basic Medical Sciences,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Department of Neurology,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo establish a nerve stem cell model possessing the potentiality of differentiating into γ-aminobutyric acid neuron-like cells(GABAergic-like cells),and provide eligible investigative vector for study on GABAergic neurons degenerative diseases.Methods Dibutyryl cyclic adenosine monophosphate(dbc AMP)was applied to induce human neuroblastoma SH-SY5Y cells,and the SH-SY5Y cells were divided into control group (0 mmol·L－1dbc AMP),0.3 mmol·L－1dbc AMP group,0.6 mmol·L－1dbc AMP group,1.0 mmol·L－1dbc AMP group and 2.0 mmol·L－1dbc AMP group;the morphological changes of SH-SY5Y cells were observed.The Image-Pro Plus 5.0 software was used to measure the length of neurites of the neuron-like cells,and the percentage of the SH-SY5Y cells with neurites longer than 30μm was calculated.The immunofluorescence cytochemistry technique was utilized to test GAD65 positive cells,and the positive rate of immune response was calculated.ResultsThe results of light microscope observation showed that the cells in control group were polygonal,circular or shuttle type with smooth membrane and clear boundaries.With the increasing of the concentrations of dbc AMP and the prolongation of time,the morphology of SH-SY5Y cells’bodies became smaller with longer processes in dbc AMP groups.The cells interwined each other and showed mature neuron phenotype in 1.0 mmol·L－1dbc AMP group.Compared with control group(31.4%±4.2%),the percentages of the cell with neurites longer than 30μm in 0.3,0.6,1.0,and 2.0 dbc AMP groups(40.1%±5.7%,47.5%±6.2%, 73.1%±3.2%,and 74.3%±6.1%)72 h after induction were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01).Compared with control group(10.2%±2.1%),the GAD65 positive expression rates in 0.3,0.6,1.0,and 2.0 mmol·L－1,dbc AMP groups(22.1%±2.4%,46.9%±3.2%,70.7%±3.4%,and 72.3%±3.7%)72 h after induction were significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01).ConclusionThe SH-SY5Y cells have the potentiality of differentiating into GABAergic-like cells,and 1.0 mmol·L－1is the optimal concentration of dbc AMP.

dibutyryl cyclic adenosine monophosphate;human neuroblastoma cells;induction;differentiation神經干細胞研究多使用小鼠神經母細胞瘤(N2A細胞株)作為細胞模型[1],但在研究人胚胎神經干細胞時,N2A細胞株有一定的局限性,因為小鼠遺傳學特征與人類相比有一定差異,尤其是在基因重組研究中不能互為替代,因此尋找一個有神經干細胞特征、適合于研究人胚胎神經干細胞定向分化的細胞模型尤為重要。人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y來源于不成熟的腫瘤性神經嵴細胞,具有干細胞特性,是研究神經細胞終末分化的重要細胞模型。雙丁酰環磷腺苷(dibutyryl cyclic adenosine monophosphate,dbc AMP)[2]、腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)[3]、佛波醇酯(tetradecanoyl phorbolacetate,TPA)[4]和維甲酸(retinoic acid, RA)[5]均能誘導SH-SY5Y細胞分化。在RA和BDNF共存的情況下,SH-SY5Y細胞具有向膽堿能神經元分化的表型[6]。但SH-SY5Y細胞能否分化為γ-氨基丁酸能神經元類型,目前尚未見報道。本研究采用不同濃度dbc AMP誘導SH-SY5Y細胞,應用免疫熒光細胞化學技術檢測SH-SY5Y細胞向γ-氨基丁酸能神經元分化的潛能,為建立一種適合于研究人類神經干細胞定向分化分子機制的細胞模型提供實驗依據。

R741

A

2013-11-22

國家自然科學基金資助課題(81171219);吉林大學211工程項目資助課題(2010)

王登莉(1987－),女,江蘇省南通市人,在讀醫學碩士,主要從事神經干細胞研究。

趙 慧(Tel:0431-85619477,E-mail:zhaohui＠jlu.edu.cn)

1671-587Ⅹ(2014)05-0933-05

10.13481/j.1671-587x.20140505