DAB2IP基因慢病毒載體構建及其在前列腺癌PC3細胞中的表達

華 興,潘文海

(1.暨南大學第四附屬醫院廣州市紅十字會醫院病理科,廣東廣州 510515;2.暨南大學第四附屬醫院廣州市紅十字會醫院泌尿外科,廣東廣州 510515)

DAB2IP基因慢病毒載體構建及其在前列腺癌PC3細胞中的表達

華 興1,潘文海2

(1.暨南大學第四附屬醫院廣州市紅十字會醫院病理科,廣東廣州 510515;2.暨南大學第四附屬醫院廣州市紅十字會醫院泌尿外科,廣東廣州 510515)

目的:構建重組慢病毒質粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP并轉染前列腺癌PC3細胞,觀察其轉染效率及其在PC3細胞中的表達。方法:以人前列腺癌PC3細胞基因組cDNA為模板PCR擴增獲得目的基因DAB2IP片段后,應用基因重組技術將目的片段克隆到PC3-pSin慢病毒表達載體,經PCR、雙酶切和測序鑒定后,重組慢病毒表達質粒和包裝質粒共轉染293FT細胞,獲得攜帶DAB2IP基因的重組慢病毒。取病毒上清感染人前列腺癌PC3細胞,以PC3-pSin-EF2為對照,分別采用RT-QPCR、Western blotting法檢測DAB2IP在靶細胞中的表達水平。結果:重組慢病毒質粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP經PCR、EcoRⅠ和NheⅠ雙酶切鑒定結果與目的基因條帶吻合,克隆測序結果與NCBI收錄的DAB2IP基因序列(NM_138709)完全一致。重組慢病毒質粒轉染293FT細胞收獲慢病毒上清可高效感染PC3細胞,對照組細胞株PC3-pSin-EF2及過表達細胞株PC3-pSin-EF2-DAB2IP 內DAB2IP基因的相對拷貝數分別為0.001±0.000和0.158±0.013,與對照組細胞比較,過表達細胞內DAB2IP基因mRNA表達水平上調(179.37±15.89)倍,差異有統計學意義(P＜0.001);Western blotting法,對照組PC3-pSin-EF2細胞中DAB2IP蛋白表達水平為內參的(1.002±0.783)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞組為內參的(2.431±0.892)倍,過表達組DAB2IP蛋白表達水平為對照組的(2.415±0.961)倍,差異有統計學意義(P＜0.01)。結論:成功構建攜帶DAB2IP基因的慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP,并使目的基因在靶細胞中穩定表達,為進一步研究DAB2IP基因的相關功能提供了優質的穩定轉染載體。

DAB2IP;慢病毒載體;前列腺腫瘤

前列腺癌是常見的泌尿系統惡性腫瘤之一,其發生發展涉及到一系列癌基因及抑癌基因的改變[1]。DAB2IP(DOC2/DAB2 interaction protein)基因是一種新發現的抑癌基因,參與細胞的信號轉導,影響細胞的生長發育和凋亡[2-3]。近來研究[4-5]發現:DAB2IP在多種惡性腫瘤的發生發展過程中表達下調,因而引起人們的關注。但DAB2IP在前列腺癌發生發展中的具體功能及作用機制尚不清楚。本研究構建攜帶DAB2IP基因的重組慢病毒載體,感染人前列腺癌PC3細胞,并使DAB2IP基因在靶細胞中穩定表達,旨在為進一步研究DAB2IP基因的相關功能提供優質的穩定轉染載體。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑人前列腺癌PC3細胞購自中山大學醫學實驗中心,293FT細胞購自美國Invitrogen公司,均為貼壁細胞;DH5α感受態細胞購自天根生化科技有限公司;cDNA表達載體pSin-EF2及包裝載體pSPAX、p MD2G購自美國Promega公司,Eco RⅠ、NheⅠ內切酶、質粒小量抽提試劑盒、質粒大提取試劑盒、膠回收試劑盒、Taq酶和DNA相對分子質量標準均購自日本Takara公司,LipofectamineTM2000、Opti-MEM培養基購自美國Invitrogen公司,0.45μm PVDF膜為美國Millipore公司產品,DAB2IP多克隆抗體、β-actin單克隆抗體均購自英國Abcom公司,其他常規化學試劑購于廣州威佳科技有限公司。

1.2 引物設計與合成根據NCBI DAB2IP基因序列(NCBI登錄號為NM_138709)全長設計合成引物:DAB2IP-F,5′-CCGGAATTCATGCCGAGGCTGAAGGAGTC-3′(Eco RⅠ);DAB2IP-R, 5′-CTAGCTAGCTTAACAATTGCTGCTGTTTCTGAACT-3′(NheⅠ),上、下游引物5′端加上Eco RⅠ和NheⅠ2個酶切位點及保護堿基,引物經BLAST軟件特異性分析,由美國Invitroigen公司合成。

1.3 重組慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP的構建以PC3細胞基因組cDNA為模板,進行PCR反應。反應完畢后行0.8%低熔點瓊脂糖凝膠電泳,切膠回收DAB2IP目的片段,用限制性內切酶Eco RⅠ和NheⅠ分別雙酶切,切膠回收目的片段和提取pSin-EF2質粒,回收酶切產物,將純化后的雙酶切產物采用Takara的快速連接酶, 16℃連接30 min,連接后命名為pSin-EF2-Puro-DAB2IP。重組質粒轉化感受態大腸桿菌DH5α,隨機挑取數個中等偏小偏圓的白色單克隆菌落,分別搖菌過夜,經PCR和酶切鑒定,陽性克隆送華大基因公司進行測序。

1.4 慢病毒包裝制備培養293FT細胞,并于轉染前1 d接種到直徑10 cm培養皿,當細胞長至80%飽和度時,將慢病毒表達載體pSin-EF2或pSin-EF2-Puro-DAB2IP分別與輔助質粒pSPAX 和p MD2G混合后,加入30μL Lipofectamine 2000陽離子脂質體,共轉染293FT包裝細胞,轉染10 h后,更換完全培養基(含10%FBS的DMEM),并在37℃、5%CO2培養箱中培養48 h,收集上清液,3 000 r·min－1離心5 min,經0.45μm PVDF膜過濾,分裝后凍存于－80℃備用。

1.5 慢病毒感染人前列腺癌細胞PC3轉染前1 d 將PC3細胞接種至24孔板中,每孔2×105個細胞,使培養細胞達到80%～85%匯合。去除孔內的培養基,將含病毒的完全培養基加入細胞培養孔中,病毒感染的同時加入工作液濃度為5 g·L－1的聚凝胺(polybrene)以增加感染效率,每12 h重復感染1次,共感染3次,感染完畢后換為1 m L的完全培養基過夜;之后加入嘌呤霉素(pruomyein,Puro)(0.5 mg·L－1)抗性篩選獲得PC3-psin-EF2和PC3-psin-EF2-DAB2IP穩定株細胞。

1.6 感染后鑒定維持抗性濃度的Puro培養液擴增穩定感染的PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞,以每孔5×105個細胞接種于6孔板,24 h后收集穩定細胞株的RNA及蛋白質,進行RT-QPCR及Western blotting法檢測。

1.7 RT-QPCR檢測DAB2IP m RNA表達水平每孔加入1 m L Trizol提取細胞總RNA,采用核酸分光光度儀定量及測定其純度,應用MMLVRT逆轉錄酶合成c DNA,使用普通PCR反應進行條件探索及優化,SYBR Premix Ex Taq Kit進行QPCR檢測DAB2IP m RNA表達情況。其中β-actin作為內參,所需引物序列如下:DAB2IP-F, 5′-AGCTGGAGCAGAGCAT AGTA-3′,DAB2IP-R, 5′-GGTGTGGAGGCCAGGTCATT-3′,擴增產物124 bp;β-actin-F,5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′,β-actin-R,5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′,擴增產物186 bp(下劃線為酶切位點)。檢測指標:目的基因m RNA相對拷貝數(DAB2IP基因與內參基因的表達差異倍數)及實驗組與對照組DAB2IP的表達差異倍數。

1.8 Western blotting法檢測DAB2IP蛋白表達水平收集PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞,采用1 m L預冷PBS洗滌2次,加入全蛋白裂解液后冰上裂解10 min。槍頭吹打以充分裂解細胞后提取總蛋白,經BCA法檢測蛋白濃度后行12%SDS-PAGE電泳分離,電轉移至PVDF膜上, 將PVDF膜浸入5%脫脂奶粉/TBST,室溫搖床緩慢搖動,封閉60 min,DAB2IP一抗4℃孵育過夜(1∶3 000稀釋)、β-actin二抗37℃孵育1 h (1∶6 000稀釋),加入凱基超敏型ECL檢測液進行發光,在暗室中行壓片、顯影和定影。結果以培清凝膠成像分析系統拍照,條帶灰度分析軟件Image J分析DAB2IP蛋白的表達水平(目標蛋白條帶與內參條帶灰度的比值。

1.9 統計學分析采用SPSS 20.0軟件對數據進行統計學處理。DAB2IP m RNA和蛋白相對表達水平以±s表示,組間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 目的片段獲得以PC3細胞基因組cDNA為模板PCR獲得目的基因DNA后,進行瓊脂糖凝膠電泳,可見3 216 bp明亮特異的目的條帶(圖1),大小與理論值一致。

2.2 重組慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP的鑒定目的基因片段經膠回收連接于pSin-EF2慢病毒載體,挑取菌落PCR鑒定陽性的單克隆進行培養,重組質粒經限制性內切酶Eco RⅠ和NheⅠ進行雙酶切后,獲得約7 500和3 216 bp的條帶(圖2),與理論值大小一致,表明DAB2IP插入pSin-EF2載體中。將鑒定出的陽性克隆送于華大基因公司進行測序,測序結果與GenBank中DAB2IP基因(NCBI,NM_138709)標準序列一致(圖3),說明重組慢病毒質粒pSin-EF2-Puro-DAB2IP構建成功。

圖1 PCR擴增目的基因DAB2IP的電泳圖Fig.1 Electrophoregram of DAB2IP gene amplified by PCRM:Marker DL 5000;Lane 1:DAB2IP.

圖2 重組質粒經Eco RⅠ和NheⅠ雙酶切鑒定的電泳圖Fig.2 Electrophoregram of identification of recombinant plasmid digested by Eco RⅠand NheⅠM:Marker DL 5000;Lane 1－3:Positive clones.

圖3 經酶切鑒定陽性克隆菌液測序結果Fig.3 Sequencing results of positive clones identified by enzyme digestion liquid

2.3 RT-QPCR檢測DAB2IP mRNA表達慢病毒感染PC3細胞后加入Puro(0.5 mg·L－1)抗性篩選獲得PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP穩定株細胞。提取RNA后行RT-QPCR檢測DAB2IP m RNA表達情況。與對照組細胞PC3-pSin-EF2比較,PC3-pSin-EF2-DAB2IP組細胞內DAB2IP基因表達水平上調(179.37± 15.89)倍(P＜0.001)。見表1。

表1 RT-QPCR檢測慢病毒感染PC3細胞后DAB2IP m RNA表達水平Tab.1 Expression levels of DAB2IP mRNA in PC3 cells after infected with lentivirus detected by RT-PCR

2.4 Western blotting法檢測DAB2IP蛋白表達收集PC3-pSin-EF2和PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞裂解液作為樣本,Western blotting法檢測DAB2IP蛋白表達情況。DAB2IP蛋白相對分子質量為118 000(圖2),經條帶灰度分析軟件測量顯示:對照組PC3-pSin-EF2細胞DAB2IP蛋白表達水平為內參的(1.002±0.783)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP細胞組為內參的(2.431± 0.892)倍,PC3-pSin-EF2-DAB2IP組DAB2IP蛋白表達水平為對照組的(2.415±0.961)倍,后2組與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.01),提示成功建立DAB2IP穩定過表達細胞株。

圖4 Western blotting法檢測慢病毒感染PC3細胞后DAB2IP蛋白表達電泳圖Fig.4 Electrophoregram of expression of DAB2IP protein in PC3 cells after infected with lentivirus detected by Western blotting methodLane 1:Vector;Lane 2:DAB2IP.

3 討論

細胞基因轉染有多種載體可供選擇,如質粒、脂質體、反轉錄病毒和腺病毒等,其中慢病毒載體作為一類來源于逆轉錄病毒的載體,以其轉染效率高、可感染分裂期和非分裂期細胞、容納外源性基因片段大等優點,在科研領域有著良好的發展前景[6-7]。慢病毒載體不僅能將目的基因整合到宿主細胞染色體中,長期穩定表達外源基因,還可為活體動物模型實驗提供高質量的包含目的基因的病毒液,產生轉基因動物,慢病毒載體是目前理想的基因治療載體系統[8-9]。

DAB2IP是Ras GTPase-activating protein (Ras GAP)家族的新成員,其與DAB2/DOC2蛋白的N末端結合,是DAB2信號途徑的下游效應器;而DAB2是重要的腫瘤抑制基因,在多種腫瘤的發生中發揮作用[10-11]。DAB2IP作為一種新的GTPase激活蛋白,是Ras和腫瘤壞死因子介導的凋亡通路等多條信號通路中的重要環節,廣泛參與細胞內多條信號通路的轉導,如MAPK/ERK、ASK1-JNK、PI3K-AKT和NF-κB信號通路等,其能結合到腫瘤抑制蛋白DOC2/DAB2的N端,介導DAB2信號通路的下游效應,從而發揮其腫瘤抑制作用[3,12-13]。

DAB2IP表達下調和抑癌功能喪失與多種腫瘤的發生發展有關,如前列腺癌、乳腺癌、胃癌、結直腸癌和肺癌等[13-14]。Chen等[15]發現:人正常前列腺上皮細胞有DAB2IP基因表達,而在前列腺癌細胞DAB2IP基因表達缺失或下調。研究[16]顯示:在前列腺癌組織中DAB2IP啟動子區域高甲基化,該區域及附近區域Cp G島胞嘧啶的甲基化可在轉錄水平調節基因的表達,引起相應的基因沉默,而去甲基化處理后又可使其恢復表達。

DAB2IP作為重要的抑癌基因,對該基因的進一步研究將為腫瘤的診斷和治療提供新途徑,有望成為治療腫瘤的突破口之一。本實驗成功構建攜帶DAB2IP基因的慢病毒表達載體pSin-EF2-Puro-DAB2IP,并使DAB2IP基因在前列腺癌PC3細胞中穩定表達,為進一步研究DAB2IP基因的相關功能提供了優質的穩定轉染載體。

[1]Perry AS.Prostate cancer epigenomics[J].J Urol,2013, 189(1):10-11.

[2]Wu K,Liu J,Tseng SF,et al.The role of DAB2IP in androgen receptor activation during prostate cancer progression[J].Oncogene,2014,33(15):1954-1963.

[3]Chen H,Karam JA,Schultz R,et al.Cloning of mouse Dab2ip gene,a novel member of the RasGTPase-activating protein family and characterization of its regulatory region in prostate[J].DNA Cell Biol,2006,25(4):232-245.

[4]Wu K,Xie D,Zou Y,et al.The mechanism of DAB2IP in chemoresistance of prostate cancer cells[J].Clin Cancer Res, 2013,19(17):4740-4749.

[5]Qiao S,Kim SH,Heck D,et al.Dab2IP GTPase activating protein regulates dendrite development and synapse number in cerebellum[J].PLoS One,2013,8(1):e53635.

[6]吳海霞,張維銘,李曉眠.基因轉染技術的發展與現狀[J].國際生物醫學工程雜志,2007,30:376-379.

[7]Thrasher AJ.Progress in lentiviral vector technologies[J].Hum Gene Ther,2013,24(2):117-118.

[8]Saenz DT,Barraza R,Loewen N,et al.Titration of feline immunodeficiency virus-based lentiviral vector preparations[J].Cold Spring Harb Protoc,2012, 2012(1):126-128.

[9]Witting SR,Li LH,Jasti A,et al.Efficient large volume lentiviral vector production using flow electroporation[J].Hum Gene Ther,2012,23(2):243-249.

[10]Harrison SC,Cooper JA,Li K,et al.Association of a sequence variant in DAB2IP with coronary heart disease[J].Eur Heart J,2012,33(7):881-888.

[11]Duan YF,Li DF,Liu YH,et al.Decreased expression of DAB2IP in pancreatic cancer with wild-type KRAS[J].Hepatobiliary Pancreat Dis Int,2013,12(2):204-209.

[12]Homayouni R,Magdaleno S,Keshvara L,et al.Interaction of Disabled-1 and the GTPase activating protein Dab2IP in mouse brain[J].Brain Res Mol Brain Res,20013, 115(2):121-129.

[13]Duggan D,Zheng SL,Knowlton M,et al.Two genomewide association studies of aggressive prostate cancer implicate putative prostate tumor suppressor gene DAB2IP[J].J Natl Cancer Inst,2007,99(24):1836-1844.

[14]Xie D,Gore C,Zhou J,et al.DAB2IP coordinates both PI3K-Akt and ASK1 pathways for cell survival and apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2009,106(47): 19878-19883.

[15]Chen H,Toyooka S,Gazdar AF,et al.Epigenetic regulation of a novel tumor suppressor gene(hDAB2IP)in prostate cancer cell lines[J].J Biol Chem,2003,278(5): 3121-3130.

[16]Yano M,Toyooka S,Tsukuda K,et al.Aberrant promoter methylation of human DAB2 interactive protein(hDAB2IP) gene in lung cancers[J].Int J Cancer,2005,113(1):59-66.

Construction of lentiviral vector of DAB2IP gene and its expression in prostate carcinoma PC3 cells

HUA Xing1,PAN Wen-hai2
(1.Department of Pathology,Forth Affiliated Hospital,Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510515,China;2.Department of Urinary Surgery,Forth Affiliated Hospital, Jinan University,Guangzhou Red Cross Hospital,Guangzhou 510515,China)

ObjectiveTo construct recombinant lentiviral vector pSin-EF2-Puro-DAB2IP transfect prostate carcinoma PC3 cells,and to observe its transfection rate and expression level in PC3 cells.MethodsThe cDNA sequences specifically targeting the DAB2IP gene were designed and cloned into lentiviral vector PC3-pSin usingDNA recombinant technique.Using PC3-pSin-EF2 as control,the 293T cells were transfected by Lipofectamine reagent for lentiviral particles packaged,and viral titer was determined.The DAB2IP mRNA and protein expression levels were examined by RT-PCR and Western blotting methods.ResultsThe PCR and sequencing analysis results confirmed that the DAB2IP gene sequence was consistent with the sequence in GeneBank.The number of DAB2IP gene copy in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells and its control PC3-pSin-EF2 cells were 0.001±0.000 and 0.158±0.013,respectively.Compared with control cells,the overexpression of m RNA in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells upregulated(179.370±15.891)times,the difference was statistically significant(P＜0.001). Compared with internal reference and control cells,the expression levels of DAB2IP protein in PC3-pSin-EF2-DAB2IP cells upregulated(2.431±0.892)times and(2.415±0.961)times respectively,the differences were statistically significant(P＜0.001).ConclusionThe lentiviral vector of the DAB2IP gene pSin-EF2-Puro-DAB2IP is successfully constructed,and its targeted gene is stably expressed in the targeted cells,which provides a basis for the further functional study of DAB2IP.

DAB2IP;lentiviral vector;prostate neoplasms

R737.25

A

2014-01-24

國家自然科學基金面上項目資助課題(81272849);廣東省科技廳科技計劃項目資助課題(2011B061200021)

華 興(1975－),男,安徽省安慶市人,副主任醫師,醫學博士,主要從事泌尿男科基礎和臨床病理研究。

潘文海(Tel:020-34403830,E-mail:pwh189＠189.cn)

時間: 2014-08-27 14:38

網絡出版地址: http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.R.20140827.1438.001.html

1671-587Ⅹ(2014)05-0938-05

10.13481/j.1671-587x.20140506