腦室內注射5,7-雙羥色胺對內側前額葉皮層錐體神經元5-HT1A受體敏感性的影響

劉彥彤,高 捷,王 爽

(1.西安醫學院生物化學與分子生物學教研室,陜西西安710021;2.西安醫學院管理學教研室,陜西西安 710021;3.西安醫學院病理生理學教研室,陜西西安 710021)

腦室內注射5,7-雙羥色胺對內側前額葉皮層錐體神經元5-HT1A受體敏感性的影響

劉彥彤1,高 捷2,王 爽3

(1.西安醫學院生物化學與分子生物學教研室,陜西西安710021;2.西安醫學院管理學教研室,陜西西安 710021;3.西安醫學院病理生理學教研室,陜西西安 710021)

目的:探討腦室內注射5,7-雙羥色胺(5,7-DHT)對內側前額葉皮層(mPFC)錐體神經元5-羥色胺-1A(5-HT1A)受體敏感性的影響,闡明5-HT1A受體對錐體神經元電活動的作用。方法:36只雄性SD大鼠隨機分為假手術組(n＝21)和5,7-DHT損毀組(n＝15)。損毀組大鼠腦室內注射5,7-DHT,假手術組大鼠腦室內注射同等劑量生理鹽水,2組大鼠靜脈注射不同劑量(0.5～128.0μg·kg－1)5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT,采用體細胞外電生理學方法觀察mPFC中錐體神經元放電頻率的變化,并靜脈注射5-HT1A受體拮抗劑WAY100635,觀察損毀組大鼠對5,7-DHT激動劑和拮抗劑的敏感性,并與假手術組進行比較。結果:在假手術組中,不同劑量(0.5～128.0μg·kg－1)8-OH-DPAT對大鼠錐體神經元的放電頻率均產生興奮-抑制式的影響,這些神經元在低劑量(0.5～32.0μg·kg－1)時被興奮,放電頻率增加(P＜0.05);而在高劑量(128.0μg· kg－1)時則被抑制,放電頻率減少。在損毀組中,不同劑量(0.5～128.0μg·kg－1)8-OH-DPAT劑量依賴性地抑制大鼠錐體神經元的電活動(df＝5,F＝3.44,P＝0.003),即放電頻率減少,未見興奮-抑制效應; WAY10035可以反轉8-OH-DPAT的抑制作用。結論:腦室內注射5,7-DHT可使大鼠mPFC錐體神經元5-HT1A受體敏感性降低。

5,7-雙羥色胺;5-HT1A受體;內側前額葉皮層;錐體神經元;電生理學

研究[1]證明:內側前額葉皮層(medial prefrontal cortex,mPFC)中50%～60%的錐體神經元和20%～30%的中間神經元上有5-羥色胺-1A (5-hydroxytryptamine-1A,5-HT1A)受體的表達。5-HT1A受體通過G蛋白與K＋通道耦聯。激活5-HT1A受體,可使細胞膜產生超極化,從而降低神經元的活動[2]。實驗[3]表明:刺激中縫背核(dorsal raphénuclei,DRN)與中縫中核(median raphénuclei,MRN)可以通過激活5-HT1A受體而抑制m PFC中錐體神經元的電活動。在m PFC中,微電泳5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)和5-HT受體激動劑也可以通過5-HT1A受體產生抑制作用。但5-HT遞質系統對于mPFC錐體神經元以及5-HT1A受體的作用并不十分清楚。本實驗以腦室內注射5,7-雙羥色胺(5,7-dihydroxytryptamine,5,7-DHT)大鼠為研究對象,采用神經電生理學方法,靜脈注射5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT,記錄mPFC錐體神經元放電頻率的改變,觀察5-HT1A受體敏感性的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和主要藥品36只雄性SD大鼠,體質量230～320 g,由西安交通大學醫學院實驗動物中心提供,許可證號:SCXK(陜)2007-001。大鼠在標準環境飼養,室溫20℃～25℃,24 h晝夜循環光照,自由攝食飲水。大鼠隨機分為假手術組(n＝21)和損毀組(n＝15)。5,7-DHT和地西帕明購自美國Sigma公司。

1.2 腦室內注射5,7-DHT損毀組大鼠經4%水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔注射麻醉,頭部固定于立體定位儀上,根據《Paxinos-Watson大鼠腦定位圖譜》確定左側mPFC的坐標位置:AP 1.30 mm,L 2 mm,D 3.8 mm[4]。注射5,7-DHT 20 g·L－1:在注射5,7-DHT前,先給大鼠注射地西帕明(25 mg·kg－1)以保護去甲腎上腺素能神經元,30 min后再注射5,7-DHT;假手術組大鼠以相同的方法給予10μL生理鹽水。

1.3 電生理記錄在腦室注射5,7-DHT后第3周進行電生理記錄。大鼠在4%水合氯醛(400 mg·kg－1)腹腔注射麻醉下行氣管及靜脈插管術后,頭部固定于立體定位儀上,根據《Paxinos-Watson大鼠腦定位圖譜》,確定右側m PFC的坐標位置:AP 2.7～3.2 mm,L 0.1～0.6 mm,D 1.5～2.5 mm[4]。在冠狀面與中線成2°角處傾斜進針,以避免損傷矢狀竇。采用玻璃微電極細胞外記錄法記錄錐體神經元的放電頻率。將信噪比大于3∶1的、穩定的單細胞放電經生物電信號采集與分析系統(CED1401 Spike2)輸入計算機后,進行實時觀察、儲存和頻率分析。采樣時間10～20 min。整個實驗過程中監測大鼠的心電變化和直腸溫度(維持在37.0°C±0.5°C)。記錄到錐體神經元自發放電后,穩定10 min,然后通過頸外靜脈注射連續給予不同劑量(0.5、2.0、8.0、32.0 和128.0μg·kg－1)的8-OH-DPAT溶液,間隔約3 min;最后1個劑量的8-OH-DPAT注射后,再靜脈注射給予5-HT1A受體拮抗劑WAY100635 (50μg·kg－1),繼續觀察放電10 min。每次注射的溶液量為0.1 m L。在藥物注射前,記錄被確認神經元的基礎電活動5～10 min。體循環給予8-OH-DPAT和WAY100635后,觀察和分析第2～3 min的放電頻率變化。

1.4 錐體神經元的確認mPFC中錐體神經元通常表現為自發放電;AP波寬＞1 ms;呈現規則、不規則或爆發式的放電形式[4]。

1.5 統計學分析采用SPSS 13.0統計學軟件進行統計學分析。2組大鼠放電頻率均以±s表示,不同劑量8-OH-DPAT作用后放電頻率的變化應用單因素方差分析,組間比較以基礎放電頻率為標準,應用Dunnett’s多重比較。

2 結果

在假手術組中,0.5～128.0μg·kg－18-OHDPAT對大鼠錐體神經元的放電頻率均產生興奮-抑制式的影響;低劑量(0.5～32.0μg·kg－1)時,錐體神經元被興奮,放電頻率增加;而在高劑量(128μg·kg－1)時錐體神經元被抑制,放電頻率減少。低劑量的興奮作用在8.0μg·kg－1時最強,放電頻率增加到(3.25±0.70)Hz,與基礎放電頻率比較差異有統計學意義(P＜0.01);當8-OHDPAT的累積劑量為128.0μg·kg－1時,錐體神經元則被抑制,放電頻率下降至(0.07±0.01)Hz;這種抑制作用也可以被WAY100635 (50μg·kg－1)完全反轉,使大鼠錐體神經元的放電率恢復為(0.46±0.06)Hz(圖1A和表1)。與假手術組比較,在損毀組中相同劑量(0.5～128.0μg·kg－1)8-OH-DPAT劑量依賴性地抑制大鼠錐體神經元的電活動,而無興奮-抑制效應。8-OH-DPAT只有達到累積劑量128μg·kg－時才能將錐體神經元放電頻率抑制到(0.34±0.07)Hz (df＝5,F＝3.44,P＜0.05)(圖1 B和表1)。

圖1 2組大鼠mPFC中錐體神經元的放電頻率Fig.1 Firing rates of pyramidal neurons in mPFC of rats in two groupsA:Sham operation group;B:5,7-DHT-lesion group.

表1 5-HT 1A受體激動劑8-OH-DPAT作用下2組大鼠mPFC錐體神經元放電頻率Tab.1 Firing rates of pyramidal neurons in mPFC of rats in two groups after treated with 5-HT1Areceptor agonist 8-OH-DPAT(±s,Hz)

表1 5-HT 1A受體激動劑8-OH-DPAT作用下2組大鼠mPFC錐體神經元放電頻率Tab.1 Firing rates of pyramidal neurons in mPFC of rats in two groups after treated with 5-HT1Areceptor agonist 8-OH-DPAT(±s,Hz)

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with basal firing rate.

Firing rate Group n Basal 8-OH-DPAT(μg·kg－1) 0.5 2.0 8.0 32.0 128.0 Sham operation 21 0.35±0.05 1.41±0.30 2.32±0.40 3.25±0.70??1.38±0.17 0.07±0.01 5,7-DHT-lesion 15 1.50±0.29 1.38±0.30 1.23±0.24 1.05±0.21 0.80±0.17 0.34±0.07?

3 討論

本實驗中所討論的神經元均位于mPFC內,其電活動的特征符合錐體神經元的鑒定標準。本文作者觀察到腦室內注射5,7-DHT后,m PFC的錐體神經元5-HT1A受體敏感性降低,8-OHDPAT對錐體神經元的興奮-抑制效應消失,可能與以下原因有關:①5-HT1A受體在大鼠腦內的廣泛分布,除了存在于錐體細胞的胞體或(和)軸丘上外,5-HT1A受體也在mPFC的γ-氨基丁酸(GABA)能中間神經元上有表達。低劑量8-OHDPAT對錐體神經元產生的興奮作用,其可能性之一是:mPFC中GABA能中間神經元優先被抑制,釋放GABA的量減少,結果導致錐體神經元的去抑制[5]。Diaz-Mataix等[6]也報道了體循環應用低劑量5-HT1A受體激動劑BAY×3702能夠導致錐體神經元的電活動增強,并被GABA能中間神經元拮抗劑反轉,說明低劑量BAY×3702優先作用于5-HT1A受體;另外,突觸前5-HT1A受體可能也參與錐體神經元活動的調節。皮層中也有5-HT7受體表達,并且與Gs蛋白耦聯促使c AMP的產生[7],因此刺激5-HT7受體也可能產生神經元的興奮。8-OH-DPAT對5-HT7受體有很高的親和力[8],所以小劑量應用8-OH-DPAT對m PFC的錐體神經元產生的興奮作用也可能是由于興奮了5-HT7受體所產生的結果。但是,現在并無證據表明在錐體和GABA能中間神經元上有5-HT7受體的表達,這仍需要進一步的研究。低劑量8-OHDPAT對錐體神經元產生的興奮作用可能性之二, 即8-OH-DPAT產生的興奮作用是因為作用于其他腦區的5-HT1A受體[9]。許多研究[10]證明:DRN 和MRN對mPFC神經元的活動起重要的調節作用,體循環應用5-HT1A受體激動劑8-OH-DPAT抑制DRN和MRN中5-HT能神經元的電活動,繼而對mPFC錐體神經元的抑制作用減弱,導致錐體神經元的電活動增強。②高劑量8-OH-DPAT對錐體神經元產生的抑制作用則很有可能是由于直接激活了所記錄的錐體神經元上的5-HT1A受體而產生的反應[11]。雖然不同細胞上5-HT1A受體敏感性的差異還有待進一步研究,但以往的研究支持這種可能性,因為不同神經元上受體表達的水平有差異。③在損毀組,體循環應用8-OH-DPAT (0.5～128.0μg·kg－1)抑制大鼠錐體神經元的電活動,而不是產生興奮-抑制效應。這種抑制作用在128.0μg·kg－1時具有顯著意義,而且可以被WAY100635完全反轉,表明這種作用是通過5-HT1A受體實現的。對這種結果的解釋可以從以下的研究中得到答案。首先,由于腦室內注射了5,7-DHT,導致了海馬結構、中腦縫核和PFC中5-HT1A受體的密度明顯降低,因此降低了皮層內5-HT1A受體影響錐體神經元活動的能力。其次,低劑量8-OH-DPAT對錐體神經元產生的興奮作用在損毀組大鼠中的消失可能是由于來源于縫核和mPFC中GABA能中間神經元的傳入增加[12],這些傳入能抑制m PFC錐體神經元的電活動,因為5-HT1A受體在GABA能中間神經元和5-HT能神經元上密度降低導致8-OH-DPAT對GABA能和5-HT能神經元活動的抑制作用減弱。另外,低劑量8-OH-DPAT對錐體神經元產生的興奮作用的消失也可能是由于海馬結構向mPFC的GABA能神經元的投射減少,這種投射可以抑制錐體神經元的電活動[13]。

綜上所述,本文作者推斷:低劑量應用8-OHDPAT使錐體神經元興奮性作用的消失可能反映了損毀組大鼠5-HT1A受體功能失調或該受體在mPFC、縫核和海馬結構中的表達降低。

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Influence of intraventricular injection of 5,7-drhydroxytryptamine in 5-HT1Areceptor sensitivity of pyramidal neurons in medial prefrontal cortex

LIU Yan-tong1,GAO Jie2,WANG Shuang3
(1.Department of Biochemistry and Molecular Biology,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China; 2.Department of Management,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China;3.Department of Pathophysiology,Xi’an Medical University,Xi’an 710021,China)

ObjectiveTo explore the influence of intraventricular injection of 5,7-drhydroxytryptamine(5,7-DHT)in 5-HT1Areceptor sensitivity of medial prefrontal cortex pyramidal neurons in the rats,and to clarity the effect of 5-HT1Areceptor on the eletronic response of pyramidal neurons.Methods36 male SD rats were randomly divided into sham operation group(n＝21)and 5,7-DHT lesion group(n＝15).5,7-DHT was injected intraventricularly in the rats in 5,7-DHT lesion group,and the same dose saline was injected in the rats in sham operation group.The rats in two groups were intravenously injected with different doses(0.5－128.0μg·kg－1)of 8-CH-DPAT.The firing rate of mPFC pyramidal neurons was recorded with extracellular electrophysioologicalexamination.The rats in two groups were intravenously injected with WAY100635,the sensitivites of the rats to 8-OH-DPAT and WAY100635 in 5,7-DHT lesion group were observed,and compared with sham operation group.ResultsThe different doses(0.5－128.0μg·L－1)of 8-OH-DDAT had an excitatory-inhibitory effect on the firing rate of mPFC pyamidal neurons in sham operation group;the neurons were excited when the doses of 8-OH-DPAT were 0.5－38.0μg·kg－1,and the firing rates were increased(P＜0.05);the neurons were inhibited when the dose of 8-OH-DPAT was 128.0μg·kg－1,and the firing rate was decreased.The different doses(0.5－218.0μg·L－1)of 8-OH-DPAT inhibited the elecctronic response of pyramidal neurons of the rats in 5,7-DHT lesion group in a dose-dependent manner(df＝5,F＝3.44,P＝0.003),and the firing rates were reduced.WAY-100635(50μg·kg－1)reversed completely the inhibition of 8-OH-DPAT.ConclusionThe sensitivity of 5-HT1Areceptor of rat mPFC pyramidal neurons can be decreased by intraventricular injection of 5,7-DHT.

5,7-drhydroxytryptamine;5-HT1Areceptor;medial prefrontal cortex;pyramidal neurons; electrophysiology

R338.2

A

2014-04-09

陜西省科技廳科研基金資助課題(2012KJXX-43);陜西省教育廳科研基金資助課題(2013JK0761)

劉彥彤(1980－),女,陜西省咸陽市人,講師,理學碩士,主要從事神經退行性疾病中樞機制的研究。

王 爽(Tel:029-86177414,E-mail:wangshuang78213＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0958-04

10.13481/j.1671-587x.20140510