利扎曲普坦對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠行為學和外周血中疼痛相關因子水平的影響

姚 剛,郝婷婷,羅翔丹,于挺敏

(1.吉林大學第二醫院神經內科,吉林長春 130041;2.吉林大學第二醫院核醫學科,吉林長春 130041; 3.吉林大學第二醫院營養部,吉林長春 130041)

利扎曲普坦對硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠行為學和外周血中疼痛相關因子水平的影響

姚 剛1,郝婷婷2,羅翔丹3,于挺敏1

(1.吉林大學第二醫院神經內科,吉林長春 130041;2.吉林大學第二醫院核醫學科,吉林長春 130041; 3.吉林大學第二醫院營養部,吉林長春 130041)

目的:觀察利扎曲普坦對偏頭痛模型大鼠行為學和外周血中疼痛相關因子的影響,探討曲普坦類藥物對偏頭痛的治療作用。方法:24只健康Wistar大鼠隨機分為空白對照組、偏頭痛組、利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組,每組6只。利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠給予利扎曲普坦灌胃,劑量為1 mg·kg－1·d－1(藥物劑量根據成人常規每日口服劑量進行換算),空白對照組和偏頭痛組大鼠給予生理鹽水灌胃(1 m L·d－1)。各組大鼠連續灌胃給藥7 d后,偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠制備硝酸甘油型偏頭痛動物模型,空白對照組和利扎曲普坦對照組給予同劑量生理鹽水,記錄各組大鼠給予藥物(硝酸甘油注射劑/生理鹽水)后60～90 min行為學表現;2 h后處死大鼠,留取外周血,檢測各組大鼠血清降鈣素基因相關肽(CGRP)、5-羥色胺(5-HT)、白細胞介素1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)水平。結果:與偏頭痛組比較,利扎曲普坦治療組大鼠行為學評分明顯降低(P＜0.05)。與空白對照組比較,偏頭痛組大鼠外周血中CGRP水平明顯升高(P＜0.05);偏頭痛組大鼠外周血中5-HT水平降低,但差異無統計學意義(P＞0.05);與空白對照組比較,利扎曲普坦對照組大鼠外周血中5-HT水平明顯升高(P＜0.05);與偏頭痛組比較,利扎曲普坦治療組大鼠外周血中5-HT水平明顯升高(P＜0.05);各組大鼠外周血中IL-1β和TNF-α水平無明顯差異(P＞0.05)。結論:利扎曲普坦能夠減輕硝酸甘油型偏頭痛模型大鼠行為學癥狀,使偏頭痛大鼠頭痛發作期外周血中5-HT水平升高,改善偏頭痛發作時血管舒縮功能紊亂的狀態,減輕因5-HT耗竭而引起的血管過度擴張。

利扎曲普坦;降鈣素基因相關肽;5-羥色胺;白細胞介素1β;腫瘤壞死因子α

目前研究[1-4]表明:偏頭痛發作時患者外周血中5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、降鈣素基因相關肽(calcitonin gene-related peptide, CGRP)、白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等細胞因子、炎癥介質的水平會發生不同的變化,而且這些變化可能與偏頭痛的發生、持續等有關。曲普坦類藥物是基于偏頭痛發病的神經血管學說發展起來的一類治療偏頭痛的特異性藥物,主要是作用于腦血管壁的5-HT1B/1D受體,收縮偏頭痛發作時擴張的腦血管,其治療機制是否涉及各種疼痛相關因子并不明確。本研究建立硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型,觀察利扎曲普坦對硝酸甘油型偏頭痛大鼠行為學癥狀的影響及其偏頭痛發作期外周血5-HT、CGRP、IL-1β和TNF-α水平的變化,探討曲普坦類藥物對偏頭痛的治療作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器24只健康SPF 級Wistar大鼠(雌雄各半),體質量200～220 g,購于吉林大學基礎醫學院動物中心,動物合格證號:SCXK(吉)2003-001。苯甲酸利扎曲普坦(湖北華源世紀藥業有限公司,產品批號:120301),硝酸甘油注射劑(山西康寶生物制品股份有限公司,產品批號:20120216),大鼠CGRP酶聯免疫檢測試劑盒、大鼠5-HT酶聯免疫檢測試劑盒、大鼠IL-1β酶聯免疫檢測試劑盒和大鼠TNF-α酶聯免疫檢測試劑盒均購自北京綠源博德生物科技有限公司。酶標儀(ELX800,美國Bio-Tek公司)。

1.2 動物分組和藥物干預大鼠飼養于吉林大學第二醫院動物實驗室,室內溫度22～26℃,相對濕度40%～60%,光暗周期12 h,自由攝取充足的水和食物,動物模型制備前適應性喂養7 d。將24只Wistar大鼠隨機分為4組,每組6只:空白對照組、偏頭痛組、利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組。利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠給予苯甲酸利扎曲普坦灌胃,劑量為1 mg·kg－1·d－1(藥物劑量根據成人常規每日口服劑量進行換算),空白對照組和偏頭痛組大鼠給予生理鹽水灌胃(1 m L·d－1)。各組大鼠連續灌胃給藥7 d后,偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠制備硝酸甘油型偏頭痛動物模型。

1.3 硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠臀部皮下注射硝酸甘油注射劑(10 mg·kg－1),制備實驗性偏頭痛動物模型,以給藥大鼠出現前肢頻繁撓頭、爬籠次數增多、雙耳發紅、往返運動增多、咬尾等不適表現為造模成功的指標[5]。空白對照組和利扎曲普坦對照組大鼠臀部皮下注射生理鹽水0.5 m L。

1.4 實驗動物行為學表現評分記錄各組大鼠給予藥物(硝酸甘油注射劑/生理鹽水)后60～90 min大鼠撓頭、爬籠、咬尾和往返運動的次數總和(每個癥狀每出現1次計1分)[6]。

1.5 標本采集及檢測指標硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備成功2 h后,各組大鼠給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉(麻醉劑量:0.3 m L·100 g－1),右心耳采血(約4 m L),3 000 r·min－1離心10 min,分離并提取血清,－20℃冰箱中保存備用。檢測各組大鼠血清中CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平,按試劑盒說明書操作,根據標準品的濃度及對應的吸光度(A)值計算出標準曲線的直線回歸方程,再根據樣品的A值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.6 統計學分析采用SAS統計學軟件進行統計分析。各組大鼠行為學評分和血清CGRP、 5-HT、IL-1β、TNF-α水平以±s表示,組間比較采用F檢驗。

2 結果

2.1 硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型制備成功率偏頭痛組和利扎曲普坦治療組大鼠均出現前肢頻繁撓頭、爬籠次數增多、雙耳發紅、往返運動增多和咬尾等不適表現,造模成功率為100%。

2.2 各組大鼠行為學評分空白對照組(7.50± 2.78)和利扎曲普坦對照組(7.92±2.25)大鼠行為學評分明顯低于偏頭痛組(40.25±9.75)和利扎曲普坦治療組(27.67±9.94)(P＜0.05),偏頭痛組大鼠行為學評分明顯高于利扎曲普坦治療組(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠血清CGRP水平偏頭痛組大鼠血清CGRP水平明顯高于空白對照組(P＜0.05);利扎曲普坦對照組與空白對照組大鼠血清CGRP水平比較無明顯差異(P＞0.05);偏頭痛組與利扎曲普坦治療組大鼠血清CGRP水平比較無明顯差異(P＞0.05)。見表1。

2.4 各組大鼠血清5-HT水平利扎曲普坦對照組大鼠血清5-HT水平明顯高于空白對照組和偏頭痛組(P＜0.05);利扎曲普坦治療組大鼠血清5-HT水平明顯高于偏頭痛組(P＜0.05);空白對照組和偏頭痛組大鼠外周血中5-HT水平比較差異無統計學意義(P＞0.05);利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠外周血中5-HT水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.5 各組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平空白對照組、偏頭痛組、利扎曲普坦對照組和利扎曲普坦治療組大鼠血清IL-1β和TNF-α水平比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平Tab.1 Levels of CGRP,5-HT,IL-1β,and TNF-αin serum of rats in varions groups [n＝6,±s,ρB/(mg·L－1)]

表1 各組大鼠血清CGRP、5-HT、IL-1β和TNF-α水平Tab.1 Levels of CGRP,5-HT,IL-1β,and TNF-αin serum of rats in varions groups [n＝6,±s,ρB/(mg·L－1)]

?P＜0.05 vs control group;△P＜0.05 vs migraine group.

Group CGRP 5-HT IL-1βTNF-α Control 39.22±14.37 85.27±31.56 5.80±2.29 169.10±27.60 Migraine 57.34±11.46?59.25±46.71 4.45±2.92 131.80±52.64 Rizatriptan control 41.95±25.28 173.47±67.26?△7.40±3.02 184.38±37.04 Rizatriptan treatment 40.51±25.32 160.32±87.99△7.95±3.54 169.82±58.72

3 討論

硝酸甘油型偏頭痛大鼠模型對于模擬偏頭痛具有良好的信度和效度[7-9]。耳紅、撓頭、爬籠、咬尾和往返運動是硝酸甘油型偏頭痛大鼠主要的行為學表現[10-12]。模型大鼠耳紅癥狀與硝酸甘油的擴血管作用有關,因此本文作者在進行行為學計分時并未采納此表現。本研究選擇“爬籠、撓頭、咬尾和往返運動”作為行為學評分的標準。研究[12]顯示:造模60～90 min內模型大鼠行為學改變較為明顯,且穩定,不適癥狀一般在3 h后逐漸消失。本研究對于模型大鼠的行為學變化觀察時點選擇在硝酸甘油造模后60～90 min,造模2 h時留取標本(頭痛期內)。本研究中行為學評分結果顯示:偏頭痛組大鼠行為學改變最明顯,利扎曲普坦治療組大鼠上述行為學改變也較為明顯,但明顯輕于偏頭痛組大鼠,2組大鼠行為學評分比較差異有統計學意義,證實利扎曲普坦能夠減輕硝酸甘油型偏頭痛大鼠的行為學癥狀。偏頭痛發病機制的三叉神經血管學說[13-14]認為:CGRP與偏頭痛的發生有密切關聯。CGRP受體拮抗劑對偏頭痛也有滿意的治療效果[15]。臨床研究[2]發現:偏頭痛發作時外周血中CGRP水平升高,而且偏頭痛的強度和持續時間與血中CGRP水平呈正相關關系。但也有研究[3]發現:在頭痛期和頭痛緩解期CGRP水平降低或無明顯變化。對于上述情況,學者們推測與留取血樣標本的時機有關:頭痛初期,CGRP由神經末梢大量釋放,而頭痛持續一段時間,CGRP經過代謝而減少,因此認為外周血中CGRP在偏頭痛發病過程中存在較大的波動[3]。本研究結果顯示:硝酸甘油注射劑制備的偏頭痛大鼠模型,在2 h時采血(頭痛發作期),外周血中CGRP水平升高,進一步證實偏頭痛發作期血清CGRP升高的這一現象;利扎曲普坦給藥組大鼠外周血中CGRP水平與空白對照組比較無明顯改變,說明利扎曲普坦對外周血中CGRP水平無明顯影響。

Nagata等[4]報道:有先兆偏頭痛患者血清5-HT水平明顯降低,而無先兆偏頭痛患者血清5-HT與對照組比較差異無統計學意義,從而認為有先兆偏頭痛患者5-HT代謝失調可能與無先兆偏頭痛患者5-HT的代謝狀態不同。付秋菊等[16]發現:硝酸甘油型偏頭痛大鼠血清5-HT水平明顯下降,給予實驗藥物痛寧膠囊治療后,血清中5-HT水平明顯升高,從而認為此藥是通過升高外周血中5-HT水平以治療偏頭痛。本研究結果顯示:偏頭痛組大鼠外周血中5-HT水平與對照組比較差異無統計學意義,但有下降趨勢,這可能與樣本量較少有一定的關系;利扎曲普坦對照組大鼠外周血中5-HT水平明顯高于空白對照組,利扎曲普坦治療組大鼠外周血中5-HT水平明顯高于偏頭痛組,提示利扎曲普坦能夠影響外周5-HT系統的代謝狀態,提高偏頭痛大鼠頭痛發作期外周血中5-HT水平,減輕因5-HT耗竭而引起的血管過度擴張。

外周血中IL-1β和TNF-α均能夠引起P物質、一氧化氮等物質增加,進而誘發血管通透性增加、血管舒張、血漿外滲以及肥大細胞脫顆粒等病理改變[17],引發疼痛。目前研究[18]認為:IL-1β和TNF-α在炎性疼痛和癌癥疼痛過程中起著至關重要的作用,而本研究并未發現硝酸甘油型偏頭痛大鼠頭痛發作期外周血中IL-1β和TNF-α有明顯的異常改變,本文作者推測IL-1β和TNF-α與偏頭痛病理生理過程的關系可能并不密切,這與偏頭痛的發病機制有關,偏頭痛的疼痛病理過程有別于炎性疼痛和癌癥疼痛等其他疼痛。

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Effects of rizatriptan on behavior and pain-related cytokines in peripheral blood of rat models with nitroglycerin-type migraine

YAO Gang1,HAO Ting-ting2,LUO Xiang-dan3,YU Ting-min1
(1.Department of Neurology,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China;2.Department of Nuclear Medicine,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China;3.Department of Nutrition, Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China)

ObjectiveTo observe the influence of rizatriptan on the behavior and pain-related cytokines in peripheral blood of the migraine model rats,and to investigate the theraputic effect of rizatriptan on migraine.MethodsA total of 24 rats were randomly divided into:control group,migraine group,rizatriptan control group and rizatriptan treatment group.The rats in rizatriptan control and rizatriptan treatment groups were intragastrically perfused with rizatriptan,1 mg·kg－1per day(according to the adult daily dose),and the rats in control andmigraine groups were perfused with normal saline,1 m L per day.After 7 d,nitroglycerin was subcutaneously injected into the buttocks of the rats in rizatriptan treatment and migraine groups to induce migraine.Normal saline was injected into the rats in control and rizatriptan control groups.At 60－90 min following nitroglycerin injection, the total number of behavioral symptoms was measured.The serum calcitonin gene-related peptide(CGRP),5-hydroxytryptamine(5-HT),interleukin-1β(IL-1β),and tumor necrosis factor-α(TNF-α)levels were determined using ELISA.ResultsCompared with migraine group,the behavioral score of the rats in rizatriptan treatment group was significantly decreased(P＜0.05).The serum CGRP level of the rats in migraine group was significantly higher than that in control group(P＜0.05).Compared with control group,the serum 5-HT level of the rats in and migraine group was decreased,but there was no significant differece(P＞0.05);the serum 5-HT level in rizatriptan control group was significantly increased(P＜0.05).The serum 5-HT level of the rats in rizatriptan treatment group was significantly increased compared with migraine group(P＜0.05).The serum IL-1βand TNF-α levels of the rats in varions groups had no significant differences(P＞0.05).ConclusionRizatriptan can relieve the behavior symptoms in nitroglycerin-induced migraine model rats,increase the serum 5-HT level,improve the vasomotor disturbance,and relieve the angiectasis.

rizatriptan;calcitonin gene-related peptide;5-hydroxytryptamine;interleukin-1β;tumor necrosis factor-α

R747.2;R-332

A

2014-01-02

吉林省衛生廳青年科研基金資助課題(2013Q020);吉林大學白求恩青年科研基金資助課題(2013206044)

姚 剛(1983－),男,陜西省勉縣人,主治醫師,醫學博士,主要從事慢性頭痛的基礎與臨床研究。

于挺敏(Tel:0431-88796298;E-mail:ytm_396＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0981-04

10.13481/j.1671-587x.20140515