黃芪甲苷對大鼠心肌局部缺血再灌注損傷的改善作用及其對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

張 靜,馬翠麗,王志國

(1.吉林大學第二醫院藥品管理部,吉林長春 130041;2.吉林大學中日聯誼醫院風濕免疫科,吉林長春 130033; 3.吉林大學南嶺校區醫院藥劑科,吉林長春 130022)

黃芪甲苷對大鼠心肌局部缺血再灌注損傷的改善作用及其對PI3K/Akt/mTOR信號通路的影響

張 靜1,馬翠麗2,王志國3

(1.吉林大學第二醫院藥品管理部,吉林長春 130041;2.吉林大學中日聯誼醫院風濕免疫科,吉林長春 130033; 3.吉林大學南嶺校區醫院藥劑科,吉林長春 130022)

目的:觀察黃芪甲苷(AS-Ⅳ)對大鼠心肌局部缺血再灌注(I/R)損傷的改善作用及其對PI3K/Akt/ m TOR信號通路的影響,闡明AS-Ⅳ對心肌I/R損傷的保護作用及可能機制。方法:選擇60只雄性Sprague-Dawley大鼠,采用阻斷左冠狀動脈前降支血流30 min再灌注120 min的方法制備局部I/R模型,隨機分為模型組(等體積生理鹽水)、AS-Ⅳ組(于再灌注前5 min靜脈注射10 mg·kg－1AS-Ⅳ)、PI3K抑制劑Wortmannin (WOR)組(于再灌注前10 min靜脈注射0.6 mg·kg－1WOR)和AS-Ⅳ＋WOR組(于再灌注前5、10min依次靜脈注射10 mg·kg－1AS-Ⅳ和0.6 mg·kg－1WOR)。同時選取15只同周齡大鼠作為正常對照(對照組)。分析各組大鼠I/R后的心臟質量、心肌缺血程度和梗死程度及心功能情況[左室收縮期平均壓(LVSP)、舒張末期壓力(LVEDP)、短軸縮短率(FS)和射血分數(EF)];采用Western blotting法檢測心肌梗死區Akt及m TOR磷酸化(p-Akt和p-m TOR)水平,特異性熒光探針DHE染色分析心肌活性氧自由基水平。結果:與對照組比較,模型組大鼠心肌缺血程度、梗死程度、LVEDP、心肌p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR及活性氧自由基水平均升高(P＜0.05),LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05)。與模型組比較,AS-Ⅳ組大鼠心肌缺血程度、梗死程度、LVEDP及活性氧自由基水平均降低(P＜0.05),心肌p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR及LVSP、FS和EF均升高(P＜0.05);與AS-Ⅳ組比較,WOR組和AS-Ⅳ＋WOR組大鼠心肌缺血程度、梗死程度、LVEDP及活性氧自由基水平均升高(P＜0.05),心肌p-Akt/Akt、p-m TOR/m TOR及LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05)。結論:AS-Ⅳ對心肌I/R損傷有改善作用,可降低心肌梗死及氧化應激程度并提高心功能,其機制可能通過激活PI3K/Akt/m TOR信號通路發揮作用。

黃芪甲苷;心肌缺血再灌注;PI3K/Akt/m TOR信號通路

心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷為心肌血供中斷一定時間內恢復血液灌注,而原缺血區發生較再灌注前更為嚴重的損傷或功能障礙[1-2]。I/R后心肌功能不僅未得到恢復,反而損傷加重,可增加心血管事件風險,如梗死面積擴大及心律失常等[3]。心肌I/R損傷可導致心臟功能受損和心肌細胞損傷等,嚴重影響了基礎疾病的預后,同時也限制了冠狀動脈溶栓術、介入術及搭橋術的應用[4-5],所以降低心肌I/R損傷對提高心血管疾病的療效有重要意義。黃芪是一種豆科植物,其提取物具有多種作用,如抗氧化、擴血管和抗炎等[6],黃芪甲苷(astragalosideⅣ,AS-Ⅳ)是黃芪提取物的有效成分,具有正性肌力作用,可用于心臟保護[7]。AS-Ⅳ可雙向調節心肌細胞內鈣穩態[8],對異丙腎上腺素誘導的心肌梗死有保護作用并可改善心肌肥厚癥狀[9-10]。目前對AS-Ⅳ改善心肌I/R損傷作用的研究少有報道。本研究通過探討AS-Ⅳ對心肌I/R損傷的改善作用及其對PI3K/ Akt/m TOR信號通路的影響,闡明AS-Ⅳ對心肌I/R損傷的保護作用及可能機制,為心肌I/R損傷的保護提供有效可行的措施。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器75只雄性Sprague-Dawley大鼠購自北京維通利華公司,合格證號:SCXK(京)2002-2003,體質量250～300 g。AS-Ⅳ購自成都曼斯特生物科技有限公司,伊文斯藍和2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)購自美國Amresco公司,PI3K特異性抑制劑Wortmannin(WOR)和Triton X-100購自美國Sigma公司,胰蛋白酶購自美國Gibco公司,BCA蛋白分析試劑盒購自碧云天生物科技公司,一抗羊抗鼠p-Akt、Akt單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,兔抗鼠p-m TOR、m TOR單克隆抗體和內參GAPDH購自美國Cell Sigaling Technology公司,二抗HRP標記的IgG購自北京中杉金橋生物技術有限公司;其他試劑均為分析純。5417R型高速低溫離心機購自德國Eppendorf公司,ELX800型酶標儀購自美國Bio-Tek公司,YJ-875型凈化工作臺購自蘇州凈化儀器廠,TS100型倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司,Mini Protean 3 Cell小型垂直電泳電泳槽購自美國Bio-Rad公司。

1.2 動物分組選取60只大鼠制備I/R模型(阻斷冠狀動脈左前降支血流30 min再灌注120 min),并隨機分為4組(n＝15):模型組、AS-Ⅳ組、WOR組和AS-Ⅳ＋WOR組。同時選取同周齡15只大鼠作為對照組。AS-Ⅳ組大鼠于再灌注前5 min靜脈注射10 mg·kg－1AS-Ⅳ,WOR組大鼠于再灌注前10 min靜脈注射0.6 mg·kg－1WOR,AS-Ⅳ＋WOR組大鼠分別于再灌注前10 和5 min依次靜脈注射0.6 mg·kg－1WOR和10 mg·kg－1AS-Ⅳ,而模型組和對照組大鼠僅給予等體積生理鹽水,各組大鼠的注藥體積均為1 m L。所有大鼠術前均在相同環境下(12 h/12 h明暗周期、60%～70%濕度及飲水飲食可自由獲取)飼養1周,狀態穩定后進行實驗。每組有8只大鼠先后用于心功能檢測、心臟解剖學指標和梗死面積評估,剩余7只中取4只用于心肌蛋白提取及Western blotting檢測,3只用于心肌活性氧自由基檢測。

1.3 心肌局部I/R模型的制備采用腹腔注射戊巴比妥鈉(100 mg·kg－1)麻醉大鼠并給予機械通氣。將充滿生理鹽水的PE-50聚乙烯管插入頸動脈和頸外靜脈分別進行血流動力學檢測和靜脈給藥及補液,術后穩定20 min后于胸部左側第4肋間打開胸腔,將心包膜剪開,采用6-0絲線結扎冠狀動脈左前降支血流30 min再灌注120 min。對照組大鼠僅穿線但不結扎,其余步驟相同。

1.4 心功能檢測于再灌注結束后檢測各組大鼠心功能。預先插入頸動脈的PE-50聚乙烯管末端與Power Lab數據采集和處理系統相連,于I/R后檢測各組大鼠心功能指標:左室收縮期平均壓(left ventricle systolic pressure,LVSP)、左室舒張末期壓力(left ventricle end-diastolic pressure, LVEDP)、短軸縮短率(fractional shortening,FS)和射血分數(ejection fraction,EF)。

1.5 心臟解剖學指標及梗死面積評估在完成心功能檢測后采用過量麻醉法處死大鼠,快速取出心臟,沖洗干凈后稱質量并記錄,生理鹽水經冠狀動脈沖洗,再次結扎冠狀動脈左前降支并用1%伊文斯藍灌流,完成后將心臟切成4～5片,用TTC復染15 min,采用中性甲醛固定,拍照,采用Optimax圖像處理軟件分析缺血面積(紅色)、梗死面積(白色)及正常面積(藍色),根據公式計算各組大鼠心肌缺血程度和梗死程度。缺血程度＝缺血面積/正常面積×100%,梗死程度＝梗死面積/缺血面積×100%。

1.6 心肌蛋白提取及Western blotting檢測p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR于再灌注結束后快速取出心臟左室前壁心肌,剪碎并充分勻漿,加入細胞裂解液,高速離心保留上清,采用二喹啉甲酸(BCA)法檢測蛋白濃度。從每組中取50μg蛋白與等體積上樣緩沖液混勻,采用10%SDS-PAGE電泳法分離,半干轉法轉移至NC膜,分別加入p-Akt(1∶200)和p-m TOR(1∶300)一抗4℃孵育過夜,加入二抗(1∶3 000)室溫孵育2 h,采用ECL法進行顯色處理,膠片曝光后觀察條帶光密度;然后采用洗脫液洗NC膜,加入Akt(1∶300) 和m TOR(1∶200)一抗4℃孵育過夜,二抗(1∶3 000)孵育2 h后,顯色處理,計算條帶光密度,分別計算p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR的比值。

1.7 熒光探針DHE染色法檢測心肌活性氧自由基水平于再灌注結束后取心臟左室心肌,均分成2份:一份取中部冠狀切面進行石蠟包埋,切成5μm厚,加入2μmol·L－1特異性熒光探針DHE染色,避光反應15 min,采用熒光顯微鏡觀察熒光強度;另一份剪碎后加入胰蛋白酶將心室肌細胞消化成單細胞懸液,加入5μmol·L－1DHE,避光反應30 min,在488 nm激發波長下,采用酶標儀檢測每組細胞的熒光強度,以熒光強度表示活性自由基水平。

1.8 統計學分析采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析。各組大鼠LVSP、LVEDP、FS、EF、心臟質量、缺血程度、梗死程度、p-Akt/ Akt、p-m TOR/m TOR和熒光強度均以±s表示,多組樣本均數比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q法。

2 結果

2.1 各組大鼠心肌I/R后的心臟解剖學及梗死指標各組大鼠心臟質量比較差異均無統計學意義(P＞0.05);與對照組比較,模型組大鼠心肌缺血程度、梗死程度均升高(P＜0.05);AS-Ⅳ組大鼠心肌缺血程度和梗死程度均低于模型組,但仍高于對照組(P＜0.05);與AS-Ⅳ組比較,WOR組和AS-Ⅳ＋WOR組大鼠心肌缺血程度和梗死程度均升高(P＜0.05),但與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 各組大鼠心肌I/R后的心功能與對照組比較,模型組大鼠LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05),LVEDP升高(P＜0.05);與模型組比較,AS-Ⅳ組大鼠LVSP、FS和EF均升高(P＜0.05), LVEDP降低(P＜0.05),且與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05);與AS-Ⅳ組比較,WOR組和AS-Ⅳ＋WOR組大鼠LVSP、FS和EF均降低(P＜0.05),LVEDP均升高(P＜0.05),但與模型組比較差異均無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 各組大鼠心肌I/R后心臟解剖學及梗死指標Tab.1 Heart anatomy and infarction indicators of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

表1 各組大鼠心肌I/R后心臟解剖學及梗死指標Tab.1 Heart anatomy and infarction indicators of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

?P＜0.05 compared with control group;△P＜0.05 compared with model group;＃P＜0.05 compared with AS-Ⅳgroup.

Group Heart mass(m/g)Degree of ischemia(η/%)Degree of infarction(η/%) Control 1.21±0.15 0 0 Model 1.10±0.27 47.5±7.6?43.2±5.1?AS-Ⅳ1.24±0.14 39.2±5.4?△35.6±4.3?△WOR 1.16±0.16 46.8±6.2?＃44.0±5.7?＃AS-Ⅳ＋WOR 1.18±0.22 48.4±7.1?＃42.3±6.8?＃

表2 各組大鼠心肌I/R后的心功能Tab.2 Heart function of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

表2 各組大鼠心肌I/R后的心功能Tab.2 Heart function of rats after myocardial I/R in various groups(n＝8,±s)

?P＜0.05 compared with control group;△P＜0.05 compared with model group;＃P＜0.05 compared with AS-Ⅳgroup.

Group LVSP(P/mm Hg)LVEDP(P/mm Hg)FS(η/%)EF(η/%) Control 122.5±6.9 7.4±1.3 44.5±4.2 81.0±2.9 Model 106.4±5.8?12.6±2.5?20.2±1.4?46.3±2.7?AS-Ⅳ114.8±4.5?△9.2±1.7?△31.6±3.1?△57.6±1.2?△WOR 108.7±5.2?＃12.7±2.8?＃21.4±2.3?＃44.3±2.3?＃AS-Ⅳ＋WOR 102.2±6.3?＃11.5±3.1?＃23.0±1.8?＃42.8±3.6?＃

2.3 各組大鼠心肌I/R后心肌PI3K/Akt/m TOR信號通路的蛋白磷酸化水平與對照組比較,模型組大鼠p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值均升高(P＜0.05);AS-Ⅳ組大鼠p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值均高于模型組(P＜0.05); 與AS-Ⅳ組比較,WOR組和AS-Ⅳ＋WOR組大鼠p-Akt/Akt和p-m TOR/m TOR比值均降低(P＜0.05),但與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1和表3。

2.4 各組大鼠心肌I/R后心肌活性氧自由基水平

與對照組比較,模型組熒光強度升高(P＜0.05);AS-Ⅳ組熒光強度低于模型組(P＜0.05),但仍高于對照組(P＜0.05);與AS-Ⅳ組比較, WOR組和AS-Ⅳ＋WOR組的熒光強度均升高(P＜0.05),與模型組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見表3和圖2(插頁四)。

3 討論

黃芪是一種應用較為廣泛的中藥材,用于多種心臟疾病的治療,其提取物皂苷可改善心功能并降低心肌細胞凋亡[6]。AS-Ⅳ具有多種生物活性,如緩解腦出血灶周圍神經元凋亡[11],對異丙腎上腺素誘導心肌梗死具有保護作用[9],提示其具有較好的心血管保護效應。心肌缺血后在一定時間內恢復再灌可伴發心肌I/R損傷,病因尚不清楚,但可降低心功能并增加心肌細胞損傷[12],I/R損傷是目前阻礙缺血心肌從恢復再灌注治療中受益的主要難題。本研究采用AS-Ⅳ干預大鼠心肌I/R損傷具有一定的可行性。

圖1 各組大鼠心肌I/R后心肌p-Akt/Akt和p-m TOR/ m TOR表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of p-Akt/Akt and p-m TOR/m TOR in myocardium of rats after myocardial I/R in various groupsLane 1:Control group;Lane 2:Model group;Lane 3:AS-Ⅳgroup; Lane 4:WOR group;Lane 5:AS-Ⅳ＋WOR group.

表3 各組大鼠心肌Akt和m TOR磷酸化水平及熒光強度Tab.3 Phosphorylation levels and fluorescence intensities of Akt and m TOR in myocardium of rats after I/R in various groups(n＝4,±s)

表3 各組大鼠心肌Akt和m TOR磷酸化水平及熒光強度Tab.3 Phosphorylation levels and fluorescence intensities of Akt and m TOR in myocardium of rats after I/R in various groups(n＝4,±s)

?P＜0.05 compared with control group;△P＜0.05 compared with model group;＃P＜0.05 compared with AS-Ⅳgroup.

Group p-Akt/Akt p-m TOR/m TOR Fluorescence intensity Control 0.22±0.03 0.18±0.04 65.3±7.1 Model 0.43±0.05?0.34±0.06?147.6±11.5?AS-Ⅳ0.67±0.09?△0.64±0.05?△113.8±8.6?△WOR 0.37±0.08?＃0.35±0.05?＃142.0±9.4?＃AS-Ⅳ＋WOR 0.45±0.06?＃0.37±0.03?＃138.2±10.2?＃

本研究證實了AS-Ⅳ對大鼠心肌I/R損傷有保護作用,主要表現在:①降低梗死程度和缺血程度;②改善心功能;③降低心肌氧化應激水平。心肌I/R可引起左心室功能紊亂,進一步發展可導致心力衰竭[13-14]。本研究中TTC/Evans blue染色法顯示:AS-Ⅳ可顯著降低梗死程度。同時為進一步分析AS-Ⅳ對心肌I/R大鼠心功能的影響,本研究分析I/R后的心功能指標(如LVSP、LVEDP、FS和EF),結果顯示:與模型組比較,AS-Ⅳ組的LVEDP降低,FS和EF升高,表明AS-Ⅳ可改善心肌I/R大鼠心功能。

PI3K/Akt/m TOR信號通路在心肌I/R損傷中起關鍵作用[15],心肌I/R可導致該信號通路激活[16-17]。PI3K是Akt和m TOR的上游激酶,2種蛋白的磷酸化形式可用于反映該信號通路的活性[18]。本研究結果顯示:模型組p-Akt和p-m TOR水平均較高,提示I/R時該通路處于激活狀態。而當給予AS-Ⅳ后,2種蛋白的磷酸化形式進一步升高,提示AS-Ⅳ可通過激活PI3K/Akt/ m TOR信號通路發揮心肌保護效果,而I/R時該通路本身處于激活狀態,可能與反饋機制有關。為進一步探討AS-Ⅳ是否通過PI3K/Akt/m TOR通路發揮心肌保護作用,本研究應用PI3K抑制劑WOR后發現:AS-Ⅳ的效應可被消除,表明PI3K/Akt/m TOR信號通路介導了AS-Ⅳ的保護效應。

研究[19]表明:氧化應激是I/R損傷的誘因,其中活性氧自由基是公認的引起I/R損傷的主要介質。活性氧自由基是外源性氧化劑或細胞內有氧代謝過程中產生的具有很高生物活性的含氧化合物的總稱,在胞內信號級聯反應中主要充當信號分子,在調控細胞生物學行為中起到重要作用。I/R期間生成的活性氧自由基加重了心肌I/R損傷。PI3K/Akt/m TOR信號通路可調控ROS水平[20],本文作者推測:AS-Ⅳ可通過激活PI3K/Akt/ m TOR信號通路來降低活性氧自由基水平,因此進一步分析AS-Ⅳ對I/R大鼠心肌氧化應激水平的影響。本研究中DHE染色發現:模型組大鼠心肌細胞的熒光強度高于對照組,提示I/R時伴有氧化應激,而AS-Ⅳ組大鼠心肌細胞熒光強度降低,同時PI3K抑制劑可消除AS-Ⅳ對活性氧自由基的降低效果,表明AS-Ⅳ可通過PI3K/Akt/m TOR信號通路來改善氧化應激水平,也進一步表明以降低氧化應激為切入點以發揮AS-Ⅳ保護心臟功能具有一定的可行性。

綜上所述,AS-Ⅳ對心肌I/R損傷有改善作用,可降低心肌梗死及氧化應激程度并提高心功能,其機制可能通過激活PI3K/Akt/m TOR信號通路發揮作用。

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Improvement effects of astragalosideⅣon myocardial focal ischemia-reperfusion injury and its influence in PI3K/Akt/mTOR signaling pathway

ZHANG Jing1,MA Cui-li2,WANG Zhi-guo3
(1.Department of Drug Administration,Second Hospital,Jilin University,Changchun 130041,China; 2.Department of Rheumatology,China-Japan Union Hospital,Jilin University,Changchun 130033,China; 3.Department of Pharmacy,Nanling Campus Hospital,Jilin University,Changchun 130024,China)

ObjectiveTo observe the improvement effects of astragalosideⅣ(AS-Ⅳ)on the myocardial focal ischemia-reperfusion(I/R)injury and its influence in PI3K/Akt/m TOR pathway,and to clarify the protectiveeffect of AS-Ⅳon myocardial I/R injury and the possible mechanisms.MethodsThe left main coronary arteries of 60 Sprague-Dawley rats were occluded for 30 min followed by a 120-min reperfusion to induce I/R model.The rats with I/R injury were randomly divided into model group(normal saline),AS-Ⅳgroup(intravenous injection of 10 mg·kg－1AS-Ⅳ5 min before reperfusion),PI3K inhibitor Wortmannin(WOR)group(intravenous injection of 0.6 mg·kg－1WOR 10 min before reperfusion)and AS-Ⅳ＋WOR group(intravenous injection of 10 mg·kg－1AS-Ⅳand 0.6 mg·kg－1WOR 5 and 10 min before reperfusion,respectively).15 age-matched SD rats were chosen as control group.The heart mass,degrees of infarction and ischemia and cardiac function,including left ventricular systolic mean pressure(LVSP),end-diastolic pressure(LVEDP),fractional shortening(FS)and ejection fraction(EF),of the rats in all groups were analyzed.Western blotting method was used to measure the phosphorylation levels of Akt and m TOR(p-Akt and p-m TOR).The specific fluorescent probe DHE staining was employed to detect the myocardial reactive oxygen species levels.ResultsCompared with control group,the degrees of infarction and ischemia,LVEDP,myocardial levels of p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR and reactive oxygen species levels of the rats were increased(P＜0.05).and the levels of LVSP,FS and EF were decreased in model group(P＜0.05).Compared with the model group,the degrees of infarction and ischemia,LVEDP and reactive oxygen species level were decreased(P＜0.05),while the levels of p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR LVSP, FS and EF of all rats in AS-Ⅳgroup were increased(P＜0.05).Compared with AS-Ⅳgroup,the degrees of infarction and ischemia,LVEDP and reactive oxygen species levels of the rats in WOR group and AS-Ⅳ＋WOR group were increased(P＜0.05),and the myocardial p-Akt/Akt,p-m TOR/m TOR and LVSP,FS,EF were decreased(P＜0.05).ConclusionAS-Ⅳhas improvement effect on myocardial I/R injury.AS-Ⅳcan reduce the extent of myocardial infarction and oxidative stress and improve the heart function,and its possible mechanism may be related to activating PI3K/Akt/m TOR signaling pathway.

astragalosideⅣ;myocardial ischemia-reperfusion injury;PI3K/Akt/m TOR pathway

R363

A

2014-02-19

吉林省發改委專項基金資助課題(2012747)

張 靜(1975－),女,吉林省長春市人,主管藥師,醫學碩士,主要從事藥物開發、劑型及臨床應用的研究。

王志國(Tel:0431-85095519-810,E-mail:1893913119＠qq.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0991-06

10.13481/j.1671-587x.20140517