血必凈對LPS誘導血管內皮細胞NO產生和iNOS及核轉錄因子κB蛋白表達的影響

宋麗娟,韓 彬

(遼寧醫學院附屬第一醫院呼吸感染科,遼寧錦州 121001)

血必凈對LPS誘導血管內皮細胞NO產生和iNOS及核轉錄因子κB蛋白表達的影響

宋麗娟,韓 彬

(遼寧醫學院附屬第一醫院呼吸感染科,遼寧錦州 121001)

目的:探討血必凈對脂多糖(LPS)誘導血管內皮細胞(VEC)損傷的保護作用,研究在血必凈干預下一氧化氮(NO)產生、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)表達及信號轉導機制。方法:將體外培養的VEC分為對照組、LPS(1 mg·L－1)組、LPS(1 mg·L－1)＋血必凈(25 g·L－1)組、LPS(1 mg·L－1)＋吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(PDTC,20μmol·L－1)組,在給予LPS前預先用血必凈和PDTC孵育1 h。采用Western blotting法檢測iNOS和核轉錄因子-κB p65(NF-κB p65)蛋白的表達情況,采用Griess法檢測上清液中NO的水平。結果:與對照組比較,LPS組VEC中NO水平、iNOS和NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01)。與LPS組比較, LPS＋血必凈組VEC中NO水平、iNOS和NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與LPS組比較,LPS＋PDTC組VEC中NO水平和iNOS及NF-κB p65蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。LPS＋血必凈組與LPS＋PDTC組比較,VEC中NO水平和iNOS蛋白表達水平差異無統計學意義(P＞0.05),LPS＋PDTC組VEC中NF-κB p65蛋白表達水平明顯低于LPS＋血必凈組(P＜0.05)。結論:血必凈能抑制VEC中NO的產生和iNOS蛋白的表達,其機制可能是通過抑制NF-κB而抑制炎癥反應。

血必凈;核轉錄因子-κB;誘導型一氧化氮合酶;一氧化氮;血管內皮細胞

近年來研究[1-2]表明:革蘭陰性菌感染所引起的膿毒血癥可導致敗血癥性休克、全身炎癥反應綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)和多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)等嚴重疾患,是臨床上危重患者死亡的首要原因。經典的抗感染治療難以有效地控制膿毒血癥的發病率及死亡率。位于革蘭陰性菌外膜中的脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)亦稱內毒素,是其致病的主要物質基礎。越來越多的研究[2]表明:血管內皮細胞(vascular endothelial cells,VEC)在LPS引起的內毒素休克和多器官功能衰竭等病理過程中也起關鍵作用。血必凈(Xuebijing,XBJ)是一類中藥復合制劑,其主要成分為紅花、川芎、丹參、赤芍和當歸等,具有抗菌、抗毒和抗炎作用[3]。目前國內研究[4]發現:血必凈對內毒素刺激的VEC有保護作用,可緩解VEC受損并可使重要臟器損傷程度減輕,研究[5]顯示:血必凈同時還具有強效抗內毒素及調節免疫功能的作用。國外研究[6]報道:當發生膿毒癥時血必凈可通過識別核轉錄因子κB(nuclear factorκB, NF-κB)起到抑制作用,但這方面的研究報道甚少。本研究觀察血必凈對LPS激活VEC中誘導型—氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、NF-κB表達及一氧化氮(nitric oxide,NO)水平的影響,旨在為臨床膿毒癥致VEC損傷后的保護提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑VEC購自上海交通大學實驗室。ECM培養基購自美國Sciencell公司;LPS購自美國Sigma公司,采用PBS配制成2 g·L－1溶液,過濾滅菌后備用;NF-κB抑制劑吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC)和NO試劑盒購自江蘇碧云天公司;兔抗人NF-κB p65和iNOS多克隆抗體購自博奧森公司;血必凈生藥濃度為500 g·L－1,10 m L/支,靜脈注射液制劑,購自天津紅日制藥廠(批號: 080108)。

1.2 VEC培養及鑒定將VEC接種于培養瓶中,采用含5%胎牛血清(FBS)、1%青霉素和鏈霉素及1%內皮生長因子(ECGS)的ECM培養基培養,2～3 d更換培養液1次,待細胞生長約80%融合時采用0.25胰蛋白酶消化傳代,取對數生長期細胞用于實驗。采用免疫熒光染色法鑒定。

1.3 實驗分組將細胞懸浮液采用無菌ECM培養液洗滌2～3次,取細胞懸液0.1μL,采用0.4%臺盼藍染色后進行細胞計數,將細胞密度調整為1×106個/孔,接種于6孔培養板,置于37℃、5%CO2培養箱中培養24 h。不同濃度血必凈對NO水平影響的實驗:①對照組,采用含10%胎牛血清的ECM培養液孵育細胞24 h; ②LPS組,將LPS(1 mg·L－1)(預實驗得出)與細胞共孵育24 h;③不同濃度血必凈組,采用12.5、25.0和50.0 g·L－1血必凈預先與細胞孵育1 h,再給予1 mg·L－1LPS與細胞共孵育24 h。血必凈和PDTC對NO、iNOS和NF-κB水平影響的實驗:①對照組,采用含10%胎牛血清的ECM培養液孵育細胞24 h;②LPS組,將LPS (1 mg·L－1)(預實驗得出)與細胞共孵育24 h; ③LPS＋血必凈組,采用25.0 g·L－1血必凈(通過前一實驗得出)預先與細胞孵育1 h,再給予1 mg·L－1LPS與細胞共孵育24 h;④LPS＋PDTC組,采用20μmol·L－1PDTC預先與細胞孵育1 h,之后加入1 mg·L－1LPS再與細胞共孵育24 h。

1.4 NO水平測定收集各處理組細胞上清液, 于4℃、5 000 r·min－1離心5 min,取上清儲存于－80℃以檢測NO水平。以NO在培養基中形成的穩定終末產物NO2－的濃度代表NO的產生量。離心后取上清液50μL,在各孔中加入50μL Griess reagentⅠ和50μL Griess reagentⅡ,于室溫下540 nm波長處測定吸光度(A)值,根據樣本的A值從標準曲線上得到樣本中NO2－的濃度。

1.5 Western blotting法檢測iNOS和NF-κB蛋白表達水平細胞培養24 h,用PBS終止刺激并洗滌細胞2次,用細胞刮勺將細胞刮下,嚴格按操作步驟提取細胞總蛋白,BCA法測定蛋白水平。取50 g樣品煮沸變性后進行SDS-PAGE電泳,轉膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,加抗iNOS和抗NF-κB p65(1∶400),4℃孵育過夜,洗膜,加入HRP標記的羊抗兔IgG,37℃下孵育1 h,DAB顯色,采用圖像分析系統分析目標帶A值,以目的蛋白與內參β-actin蛋白A值的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.6 統計學分析采用SPSS 17.0統計軟件進行統計學處理。各組細胞上清中NO水平和iNOS、NF-κB蛋白表達水平以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 不同濃度血必凈作用下LPS誘導的VEC中NO水平與對照組比較,LPS組和LPS＋血必凈組VEC中NO水平明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.01);與LPS組比較,不同濃度量血必凈組VEC中NO的水平明顯下降(P＜0.05)。25.0 和50.0 g·L－1血必凈組VEC中NO水平明顯低于12.5 g·L－1血必凈組(P＜0.05)。見表1。本實驗得出血必凈最適濃度為25 g·L－1。

表1 血必凈作用下VEC中NO的水平Tab.1 Levels of NO in VEC after treated with XBJ [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

表1 血必凈作用下VEC中NO的水平Tab.1 Levels of NO in VEC after treated with XBJ [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05 compared with LPS group;＃P＜0.05 compared with 12.5 g·L－1XBJ group.

Group NO Control 1.993±0.553 LPS(1 mg·L－1)24.155±5.171??LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(12.5 g·L－1)16.672±2.115?△LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(25.0 g·L－1)12.174±1.259?△＃LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(50.0 g·L－1)9.680±2.348??△＃

2.2 血必凈和PDTC作用下LPS誘導的VEC中NO水平與對照組比較,LPS組NO的水平明顯升高,差異有統計學意義(P＜0.01);與LPS組比較,LPS＋血必凈(25 g·L－1)組和LPS＋PDTC組VEC中NO水平明顯降低(P＜0.05或 P＜0.01),而后二組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表2。

2.3 各組VEC中iNOS蛋白表達水平與對照組比較,LPS組VEC中iNOS蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01);與LPS組比較,LPS＋血必凈組和LPS＋PDTC組VEC中iNOS蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);而后二組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。見圖1和表3。

表2 各組VEC中NO水平Tab.2 Levels of NO in VEC in various groups [n＝6,±s,cB/(μmol·L－1)]

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with LPS group.

Group NO Control 1.666±0.562 LPS(1 mg·L－1)24.891±2.841??LPS(1 mg·L－1)＋XBJ(25.0 g·L－1)11.806±1.601?△LPS(1 mg·L－1)＋PDTC(20μmol·L－1)8.822±0.921?△△

圖1 Western blotting法檢測各組VEC中iNOS蛋白表達電泳圖Fig.1 Electrophoregram of expressions of iNOS protein in VEC in various groups detected by Western blotting method Lane 1:Control group;Lane 2:LPS group;Lane 3:LPS＋XBJ group;Lane 4:LPS＋PDTC group.

表3 各組VEC中iNOS和NF-κB p65蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of iNOS and NF-κB p65 proteins in VEC in various groups(n＝3,±s)

表3 各組VEC中iNOS和NF-κB p65蛋白表達水平Tab.3 Expression levels of iNOS and NF-κB p65 proteins in VEC in various groups(n＝3,±s)

?P＜0.05,??P＜0.01 compared with control group;△P＜0.05,△△P＜0.01 compared with LPS group;＃P＜0.05 compared with LPS＋XBJ group.

Group iNOS NF-κB p65 Control 0.096±0.012 0.043±0.005 LPS(1 mg·L－1)0.844±0.119??0.197±0.036??LPS(1 mg·L－1)＋XBJ (25.0 g·L－1)0.452±0.052?△△0.104±0.014?△LPS(1 mg·L－1)＋PDTC (20μmol·L－1)0.297±0.064?△0.069±0.011?△△＃

2.4 各組VEC中NF-κB p65蛋白表達水平與對照組比較,LPS組VEC中NF-κB p65蛋白表達水平明顯升高(P＜0.01);與LPS組比較, LPS＋XBJ組和LPS＋PDTC組VEC中NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與LPS＋血必凈組比較,LPS＋PDTC組VEC中NF-κB p65蛋白表達水平明顯降低(P＜0.05)。見圖2和表3。

圖2 Western blotting法檢測各組VEC中NF-κB p65蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of NF-κB p65 protein in VEC in variuos groups detected by Western blotting methodLane 1:Control group;Lane 2:LPS group;Lane 3:LPS＋XBJ group;Lane 4:LPS＋PDTC group.

3 討 論

血必凈是一類活血化瘀的中藥復合制劑,含多種藥物成分,其中主要有效成分為丹參素、川芎嗪、芍藥苷、紅花黃色素和阿魏酸等,有以下幾種重要的作用:①調節免疫應答;②強效拮抗內毒素;③清除氧自由基;④調節凝血系統的活性;⑤擴張冠脈和外周血管,降低血管通透性等。本研究以VEC為研究對象,以iNOS和NO為靶點探討血必凈保護VEC的作用機制。

目前一氧化碳合酶(NOS)有3種異構體,分別為神經元型一氧化氮合酶(n NOS)、內皮型一氧化氮合酶(eNOS)和iNOS。其中eNOS有調節鈣離子活性的作用,iNOS和n NOS與毒素和細胞因子的介導有密切關系,并參與轉錄及翻譯等一系列復雜的過程從而調節NO的生成量[7]。正常情況下,VEC中iNOS維持在一個較低水平,當受到外界因素如感染及發生應激性反應的情況下,尤其是膿毒血癥、SIRS、MODS等,iNOS表達水平明顯高于正常水平,最終使NO生成量增高[8]。NO是由NOS催化左旋精氨酸(L-Arg)的氧化反應生成,用以舒張血管和抑制血小板凝集,對維持正常的VEC及其完整性非常重要[9]。然而,在未感染之前,細胞中僅含有微量的NO (pmol),當NO產生過量時,會出現細胞損傷,使毛細血管的通透性增加,滲出增加,同時可以抑制心肌收縮力及降低血管多種收縮因子的敏感度,從而導致感染性休克的發生。

血必凈對抗炎癥保護臟器的作用已得到多個學者的認可,其相關研究也較多。周紅萍等[10]研究發現:血必凈可降低體內內毒素的水平;雪琳等[11]在研究LPS誘導發生MODS的模型中觀察到血必凈能抑制TNF-α的表達;李志軍等[12]在家兔研究中得出血必凈可降低LPS刺激VEC后產生一系列應激性反應如NOS水平和內皮素表達等。謝穎光等[13]證實:血必凈注射液能顯著降低重癥患者血循環中NO水平,可以保護重癥患者的VEC,改善重癥患者的病情。朱海云等[14]發現:血必凈注射液可降低膿毒癥大鼠iNOS表達水平,表明血必凈注射液能抑制膿毒癥大鼠iNOS的表達。趙光舉等[15]觀察了血必凈注射液對創傷弧菌膿毒癥大鼠肺組織iNOS活性和NO水平影響的結果表明:血必凈注射液能顯著下調肺組織中iNOS活性及NO生成。本研究結果與謝穎光等[13]和朱海云等[14]的研究結果相符合。由此可見,血必凈可通過降低NO水平和iNOS表達以改善LPS導致的炎性損傷,從而能起到保護血管內皮的作用。

本研究結果顯示:LPS能上調VEC中iNOS 和NF-κB p65表達及NO水平,分別加入血必凈及阻斷劑組PDTC后,VEC中iNOS、NF-κB p65的表達和NO水平均有所下調,且2組iNOS表達和NO水平下降較接近,這說明血必凈抑制VEC 中iNOS表達和NO水平可能是通過抑制NF-κB發揮作用,也間接地反映了LPS可能通過激活NF-κB通路上調iNOS蛋白表達和NO水平,從而發生了瀑布式連鎖反應。另外,本實驗選擇NF-κB p65亞基作為靶基因,發現血必凈和NF-κB阻斷劑PDTC均顯著抑制NF-κB p65蛋白表達。NF-κB p65蛋白是NF-κB的一個關鍵的轉錄亞基,最常見的NF-κB以異源二聚體P65∶P50的形式出現[16]。NF-κB作為細胞中重要的核轉錄調節因子,是多條炎癥通路的交匯點[17],這與國內研究[18]報道的血必凈能抑制NF-κB的表達、有效降低膿毒癥患者病死率,進而抑制血管內膜炎性反應的研究結果相吻合。但由于預先給予血必凈及阻斷劑處理后未降到正常水平,從而推斷LPS感染VEC可能僅部分激活NF-κB,說明還有可能通過其他通路介導。由此可推斷:血必凈有可能通過抑制NF-κB的激活以抑制LPS誘導的VEC中iNOS表達和NO水平,進而發揮抗炎和保護內皮的作用。

綜上所述,血必凈可通過抑制NF-κB活性進而抑制炎癥反應和VEC損傷,其具體機制有待進一步研究。

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Influence of Xuebijing in production of NO and expressions of iNOS and NF-κB induced by LPSin vascular endothelial cells

SONG Li-juan,HAN Bin
(Department of Respiratory and Infections Medicine,First Affiliated Hospital,Liaoning Medical University, Jinzou 121001,China)

ObjectiveTo investigate the protective effects of Xuebijing(XBJ)on the injury of vascular endothelial cells(VEC)induced by lipopolysaccharide(LPS),and to study the mechanisms of the production of nitric oxide (NO)and the expressions of inducible nitric oxide sytnhase(iNOS)and signal transduction under XBJintervention condition.MethodsThe cultured VEC were divided into control group,LPS(1 mg·L－1)group,LPS (1 mg·L－1)＋XBJ(25 g·L－1)group,LPS(1 mg·L－1)＋pyrrolidine dithiocarbamate(PDTC,20μmol·L－1) group;XBJ and PDTC were administrated 1 h before incubation of with LPS.Western blotting method was used to detect the expressions of iNOS and NF-κB p65 protein.The level of NO in the supernatant was measured by Griess reagent.ResultsComparaed with control group,the NO level and the expression levels of iNOS protein and NF-κB p65 protein in VEC in LPS group were significantly increased(P＜0.01).Compared with LPS group,the NO level and the expression levels of iNOS protein and NF-κB p65 protein in VEC in LPS＋XBJ group weresignificantly decreased(P＜0.05 or P＜0.01);the NO level and the expression levels of NF-κB p65 protein and iNOS protein in VEC in LPS＋PDTC group were significantly decreased(P＜0.05 or P＜0.01).There were no significant differences of the NO levels and the expression levels of iNOS protein between LPS＋XBJ group and LPS＋PDTC group(P＞0.05),but the expression level of NF-κB p65 protein in LPS＋PDTC group was lower than that in LPS＋XBJ group(P＜0.05).ConclusionXBJ can inhibit the production of NO and the expression of iNOS protein in VEC;its mechanism may be related to inhibiting the activation of NF-κB to control inflammation.

Xuebijing;nuclear factorκB;inducible nitric oxide synthase;nitric oxide;vascular endothelial cells

R285.5

A

2013-11-28

遼寧省科技廳自然科學基金資助課題(20092189)

宋麗娟(1981－),女,山西省大同市人,在讀醫學碩士,主要從事呼吸感染與膿毒癥方面的研究。

韓 彬(Tel:0416-4197095,E-mail:hanbin9500＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-0997-05

10.13481/j.1671-587x.20140518