阿托伐他汀對同型半胱氨酸作用下人臍靜脈內皮細胞Bcl-2啟動子區甲基化水平的影響及其抗動脈粥樣硬化機制

李 錄,侯建軍,邱榮榮,賈紹斌,叢廣志,孫 娜

(1.南京醫科大學附屬無錫市第二人民醫院心內科,江蘇無錫 214002;2.寧夏醫科大學總醫院心臟中心心內科,寧夏銀川 750004;3.陜西省渭南市中心醫院心內科,陜西渭南 714000)

阿托伐他汀對同型半胱氨酸作用下人臍靜脈內皮細胞Bcl-2啟動子區甲基化水平的影響及其抗動脈粥樣硬化機制

李 錄1,侯建軍2,邱榮榮1,賈紹斌2,叢廣志2,孫 娜3

(1.南京醫科大學附屬無錫市第二人民醫院心內科,江蘇無錫 214002;2.寧夏醫科大學總醫院心臟中心心內科,寧夏銀川 750004;3.陜西省渭南市中心醫院心內科,陜西渭南 714000)

目的:探討阿托伐他汀對同型半胱氨酸(Hcy)作用下人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)Bcl-2基因啟動子區甲基化水平及其表達的影響,闡明阿托伐他汀抗動脈粥樣硬化(AS)的可能機制。方法:HUVECs分別采用含有0、2、4、8、16和32 mmol·L－1Hcy的RPMI 1640培養液作用48 h,采用MTT實驗檢測細胞增殖抑制率及半數抑制濃度(IC50),根據IC50結果將本實驗分為對照組(0 mmol·L－1Hcy)、Hcy組(9.00 mmol·L－1Hcy)、阿托伐他汀組(9.00 mmol·L－1Hcy＋1×10－3mmol·L－1阿托伐他汀)。各組細胞培養48 h后,流式細胞術檢測細胞凋亡率,熒光定量PCR法檢測Bcl-2基因的m RNA表達,Western blotting法檢測Bcl-2蛋白表達水平,甲基化特異性PCR(MSP)聯合巢式降落式PCR法檢測Bcl-2啟動子區甲基化水平。結果:與對照組比較,Hcy組細胞凋亡率上升(P＜0.01),Bcl-2基因m RNA及蛋白表達水平下降(P＜0.01), Bcl-2基因啟動子區甲基化水平降低(P＜0.01);與Hcy組比較,阿托伐他汀組內皮細胞凋亡率下降(P＜0.01), Bcl-2基因m RNA及蛋白表達水平增加(P＜0.05),Bcl-2基因啟動子區甲基化水平升高(P＜0.05)。結論:阿托伐他汀可通過調節Hcy作用下的HUVECs Bcl-2基因甲基化水平抑制細胞凋亡。

阿托伐他汀;動脈粥樣硬化;同型半胱氨酸;Bcl-2蛋白;DNA甲基化;細胞凋亡

高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia, H Hcy)是動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的獨立危險因素[1-2]。HHcy致AS的機制并不完全清楚,有報道[3]顯示:AS的發生與內皮細胞的凋亡有關。同型半胱氨酸(homocystein,Hcy)的代謝過程可引起DNA甲基化水平的改變[4-6]。Bcl-2基因是調節凋亡的關鍵基因,本課題組前期的動物實驗研究[7]發現:HHcy大鼠主動脈的Bcl-2基因發生了去甲基化,致Bcl-2表達水平改變,引起平滑肌細胞凋亡失衡,從而導致AS的發生。阿托伐他汀是1種3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A(HMG-Co A)還原酶抑制劑。他汀類藥物能有效降低膽固醇,在AS的治療中發揮了重要的作用。但他汀類藥物對AS的治療作用并不能完全以降低膽固醇的作用來解釋,非降脂相關的心血管保護作用,受到學者廣泛的重視[8]。阿托伐他汀是否可以通過調節Bcl-2啟動子區甲基化水平而影響內皮細胞凋亡程度,從而起到延緩AS的進展少見報道。本實驗通過研究阿托伐他汀對Hcy作用下人臍靜脈內皮細胞(human umbilical endothelial cells,HUVECs)的Bcl-2啟動子區甲基化水平及表達的影響,探討阿托伐他汀拮抗HHcy致AS的可能機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、主要試劑和儀器HUVECs株(ATCC公司,美國);Hcy(Sigma公司,美國), RPMI 1640培養液(Hyclone公司,美國),胎牛血清(北京全氏金生物技術有限公司),MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(南京凱基生物科技發展有限公司),細胞凋亡檢測試劑盒(上海貝博生物公司),Trizol試劑(Invitrogen公司,美國),兔源多克隆抗Bcl2抗體(武漢三鷹生物技術有限公司), EZ DNA Methylation-GoldTMKit和DNA甲基化陽性對照(ZYMO公司,美國),DNA提取純化試劑盒、SYBR Green qPCR supermix和2×Gotag Green Master Mix(Promega公司,美國);CO2培養箱(Heal Force公司,德國),倒置顯微鏡(Olympus公司,日本),單激光三色流式細胞儀(BD公司,美國),熒光定量PCR儀(Roche公司,瑞士),蛋白電泳、轉移裝置系統(Bio-Rad公司,美國)。Bcl-2 mRNA引物及甲基化特異性PCR (MSP)引物均由上海生工生物有限公司合成。

1.2 HUVECs培養及實驗分組細胞培養:以含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液,在5%CO2、37℃飽合濕度的培養箱中培養HUVECs,隔日更換培養液。用0.25%胰酶常規消化、傳代。實驗分組:對照組(RPMI 1640培養液＋HUVECs)、Hcy組(RPMI 1640培養液＋HUVECs＋Hcy)和阿托伐他汀組(RPMI 1640培養液＋HUVECs＋Hcy＋阿托伐他汀)。作用時間為48 h。放置Hcy濃度由MTT實驗計算得出的IC50確定;阿托伐他汀終末濃度為1×10－3mmol·L－1。

1.3 MTT法測定細胞增殖生長能力分別采用含0、2、4、8、16和32 mmol·L－1Hcy的培養液作用細胞48 h,參照細胞增殖實驗試劑盒說明書操作,于酶標儀490 nm波長處檢測吸光度(A) 值,并計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率＝[1－(對照組A值－實驗組A值)/對照組A值]×100%。計算IC50公式如下:lg IC50＝XK-d/2∑(Pi＋Pi＋1)[9]。Xk:lg最大劑量; d:最大及相鄰2組劑量對數之差;Pi,Pi＋1:為第i組及i＋1組抑制率。

1.4 流式細胞術測定細胞凋亡用0.25%胰酶消化、收集細胞,用冷PBS洗滌細胞3次,400μL 1×AnnexinⅤ結合液懸浮細胞,濃度約為1×106m L－1。加入5μL 1×Annexin V-FITC染色液,4℃避光孵育15 min。加入10μL PI染色液后混勻4℃避光孵育5 min。以流式細胞儀進行檢測,激發波長為488 nm。實驗結果以細胞早期和晚期凋亡率之和表示。

1.5 熒光定量PCR法測定Bcl-2基因mRNA表達采用Trizol法提取細胞總RNA,每組取1 mg 總RNA,反轉錄為cDNA。配制20μL PCR反應體系:無核酶水5.2μL、上下游引物各0.4μL,引物序列(上游引物:5′-ATGTGTGTGGAGAGCGTCAA-3′;下游引物:5′-ACCTACCCAGCCTCCGTTAT-3′)、cDNA 4μL、SYBR Green qPCR supermix,10μL。反應條件:95℃、2 min,1個循環;95℃、15 s,60℃、1 min,共40個循環;以β-actin為內參照,m RNA表達水平以2－△△ct值表示。

1.6 Western blotting法測定Bcl-2蛋白表達采用凱基生物全蛋白提取試劑盒,行全蛋白的提取, BCA法測定蛋白表達水平。將蛋白樣本加入等體積的2×上樣緩沖液,沸煮變性。每孔加入60μg樣品行SDS-PAGE電泳轉膜;麗春紅染膜;封閉;加入一抗4℃過夜。洗膜后加二抗室溫孵育1 h; TBST洗膜;滴加ECL化學發光液,避光孵育1 min,暗室中曝光5 min。Image J圖像分析系統測定A值,以β-actin為內參照,蛋白表達水平以目標條帶A值與內參照條帶A比值表示。

1.7 DNA提取及亞硫酸鹽修飾按照DNA提取純化試劑盒說明書提取DNA,并測定其濃度。每組分別取500 pg DNA,用去離子水將其體積調整到20μL,加入130μL CT轉化試劑,98℃孵育10 min,64℃孵育2.5 h,經脫硫后,用10μL溶解液洗脫DNA,－80℃保存。

1.8 甲基化特異性PCR(methylation-specific PCR,MSP)法測定Bcl-2基因啟動子區甲基化水平聯合MSP及巢式降落式PCR。使用Methptimer軟件設計Bcl-2(NM_138764)外引物和MSP引物(外引物:上游引物,5′-GTTTTGTTTTTATTTATTTAGTAGTTTTT-3′,下游引物,5′-AATCCTATAATATTTTCCCCTTCTC-3′,產物長度224 bp;甲基化引物:上游引物, 5′-GTTTTCGTTTTCGGTTTTTTTATC-3′,下游引物,5′-CCTATAATATTTTCCCCTTCTCGAC-3′,產物長度146 bp;非甲基化引物:上游引物,5′-TTTTTGTTTTTGGTTTTTTTATTGT-3′,下游引物,5′-CCTATAATATTTTCCCCTTC TCAAC-3′,產物長度145 bp。建立50μL PCR體系:2×Gotag Green Master Mix,25μL,無核酶水20μL、上下游引物各1μL、DNA模板3μL。反應條件:95℃預變性10 min, 1個循環;95℃變性30 s,退火溫度68℃→48℃,每個循環降低1℃,72℃延伸30 s,共擴增20個循環;50℃退火溫度下再擴增30個循環。PCR產物行2.5%瓊脂糖凝膠電泳,以Quantity One軟件測量條帶灰度(A)值。Bcl-2基因啟動子區甲基化水平檢測結果以甲基化A值與非甲基化條帶A值之比(M·U－1)表示。同時設置DNA甲基化陽性對照及以水為模板的空白對照。

1.9 統計學分析采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析。各組A值、細胞增殖抑制率、細胞凋亡率、m RNA和蛋白表達水平以及甲基化水平均以±s表示,組間均數比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 HUVECs增殖抑制率隨著Hcy濃度的增加,A值由0.99±0.05漸降低至0.28±0.03,細胞增殖抑制率由0.00上升到71.72%。與對照組比較,各Hcy組A值下降,細胞增殖抑制率上升,且呈劑量效應關系(P＜0.01)。根據公式計算出IC50為9.28 mmol·L－1,取其近似值9.00 mmol·L－1作為后續實驗Hcy濃度。見表1。

表1 MTT法檢測各組HUVECs增殖抑制率Tab.1 Inhibitory rates of proliferation of HUVECs in various groups detected by MTT(n＝6)

2.2 流式細胞術檢測細胞凋亡率第一象限為晚期凋亡細胞,第四象限為早期凋亡細胞,將2個象限之和即為細胞凋亡率。對照組的細胞凋亡率為(2.30±0.60)%,Hcy組為(16.40±0.73)%, 2組間比較差異有統計學意義(P＜0.01),阿托伐他汀組細胞凋亡率[(8.35±0.33)%]較Hcy組降低(P＜0.01)。見圖1。

2.3 Bcl-2基因m RNA的表達采用2－△△ct法對數據進行統計分析。對照組Bcl-2基因m RNA相對表達水平為1.00±0.00,Hcy組Bcl-2基因m RNA相對表達水平為0.45±0.14,與對照組比較,Hcy組Bcl-2基因m RNA表達水平明顯下降(P＜0.01);阿托伐他汀組Bcl-2基因m RNA相對表達水平為0.64±0.04,與Hcy組比較,阿托伐他汀組Bcl-2基因m RNA表達水平明顯升高(P＜0.05)。

圖1 流式細胞術檢測各組HUVECs凋亡率Fig.1 Apoptotic rates of HUVECs in various groups detected by FCMA:Control group;B:Hcy group;C:Atorvastatin group.

2.4 Bcl-2蛋白的表達對照組Bcl-2蛋白表達水平為0.89±0.04,Hcy組Bcl-2蛋白表達水平為0.56±0.05,與對照組比較,Hcy組Bcl-2蛋白表達水平下降(P＜0.01);阿托伐他汀組Bcl-2蛋白表達水平為0.67±0.02,與Hcy組比較,阿托伐他汀組Bcl-2蛋白表達水平升高(P＜0.05)。見圖2。

圖2 Western blotting法檢測各組HUVECs中Bcl-2蛋白表達電泳圖Fig.2 Electrophoregram of expressions of Bcl-2 protein in HUVECs in various groups detected by Western blotting methodLane 1:Control group;Lane 2:Hcy group;Lane 3:Atorvastatin group.

2.5 MSP法檢測Bcl-2基因啟動子區甲基化水平

對照組Bcl-2基因啟動子區甲基化水平(M·U－1)比值為1.96±0.26,Hcy組為1.20± 0.19,與對照組比較,Hcy組Bcl-2基因啟動子區甲基化水平下降(P＜0.01);阿托伐他汀組(M·U－1)比值為1.58±0.08,與Hcy組比較,阿托伐他汀組Bcl-2基因啟動子區甲基化水平升高(P＜0.05)。見圖3。

圖3 各組HUVECs中Bcl-2啟動子區甲基化水平檢測電泳圖Fig.3 Electrophoregram of detection of Bcl-2 promoter region methylation levels in HUVECs in various groupsM:Marker;Lane 1,2:Control group;Lane 3,4:Hcy group;Lane 5, 6:Atorvastatin group;Lane 7,8:Positive control group;Lane 9,10: H2O;Lane 1,3,5,7,9:Methylation bands(146 bp);Lane 2,4,6,8, 10:Non-methylation bands(145 bp).

3 討論

有研究[10]表明:H Hcy致AS作用與其促進血管內皮細胞的凋亡有關,且Bcl-2基因在細胞凋亡過程中起到了重要的抑制性調節作用。近年來隨著表觀遺傳學研究的深入,研究者[11]發現DNA甲基化與心血管疾病,特別是AS的關系密切。DNA甲基化是指DNA在甲基轉移酶的作用下,使5′-Cp G-3′二核苷酸上胞嘧啶發生甲基化,從而形成5-甲基胞嘧啶[12]。CpG二核苷酸主要存在于基因啟動子區的Cp G島[13]。Cp G島甲基化后一方面可直接干擾轉錄因子與DNA調控區域的結合,另一方面則可間接與甲基結合蛋白相結合,占據轉錄因子在DNA上的結合位點,影響基因的轉錄和表達,基因就可通過對CpG位點甲基化狀態的調控而實現對基因表達水平的調控,影響其生物學特征。

阿托伐他汀是一種HMG-Co A的選擇性抑制劑,能抑制HMG-Co A還原酶和膽固醇在肝臟的生物合成,并增加肝細胞表面的低密度脂蛋白(LDL)受體數目而增加LDL的攝取和分解,同時能不同程度地提高血漿高密度脂蛋白膽固醇的水平,在抗AS的過程中起到了不可替代的治療作用。研究[14]發現:阿托伐他汀可通過上調Bcl-2基因的表達而延緩血管內皮細胞的衰老和凋亡。Bcl-2基因是調節細胞凋亡的關鍵基因,可通過抑制細胞色素C向胞漿的釋放,阻止Caspase-9前體的活化,從而最終阻止Caspase-3的活化,防止凋亡的發生。但Bcl-2甲基化在阿托伐他汀延緩細胞凋亡的過程中是否起到了調節性作用并不清楚。因此本實驗通過觀察阿托伐他汀對Hcy作用下HUVECs的Bcl-2基因啟動子區甲基化水平及表達的影響,探討阿托伐他汀降脂作用以外的可能潛在的抗AS機制,為阿托伐他汀抗AS的非降脂相關作用提供新的解釋。

本實驗結果顯示:與對照組比較,Hcy組Bcl-2基因啟動子區甲基化水平明顯降低,Bcl-2基因m RNA和蛋白表達水平下降,HUVECs的增殖能力下降,凋亡水平明顯增加。與Hcy組比較,阿托伐他汀組HUVECs的Bcl-2基因啟動子區的甲基化水平上凋,同時Bcl-2基因的m RNA及蛋白表達水平明顯升高,細胞的增殖能力增強,細胞凋亡水平下降。

Hcy是甲硫氨酸代謝過程中的重要中間產物,其代謝過程中生成的S-腺苷甲硫氨酸(SAM)經其水解酶水解生成S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)和甲基,SAH經其水解酶水解形成Hcy。該過程中產生的甲基經甲基轉移酶作用,可使基因組DNA發生甲基化。但當發生H Hcy時,反應趨向于生成SAH,SAH是甲基轉移酶的強力抑制劑,可使DNA甲基化過程受阻,這與本次實驗得到的Hcy可致Bcl-2啟動子區去甲基化的結果在理論上是相符的。但Devlin等[15]發現:HHcy對鼠H19基因甲基化水平的影響在肝臟與主動脈組織中截然不同,提示Hcy對DNA甲基化水平的調節極其復雜,并可能有組織特異性。本實驗結果顯示:Hcy在致Bcl-2基因甲基化水平下調后,其m RNA和蛋白表達水平下降,內皮細胞凋亡增加,可能正是得益于內皮細胞的凋亡,吞噬了LDL的單核細胞才得以在動脈內膜下浸潤,形成AS的早期病變。本實驗結果顯示:阿托伐他汀可以上調Bcl-2基因啟動子區的甲基化水平,并上調其m RNA和蛋白的表達水平,對抗Hcy引起的內皮細胞凋亡。上述作用可以保持血管內膜的完整性,維持血管內皮的正常生物功能,防止泡沫細胞在血管內皮下的浸潤,這可能是阿托伐他汀治療AS的重要機制之一。

綜上所述,阿托伐他汀可上調Bcl-2基因啟動子區的甲基化水平,并增加其mRNA和蛋白的表達水平,對抗Hcy的致內皮細胞凋亡作用,是阿托伐他汀治療AS的重要機制之一。目前存在的問題在于阿托伐他汀是HMG-Co A還原酶抑制劑,本身并不含有甲基集團,也不參與甲基代謝,阿托伐他汀如何影響Bcl-2基因啟動子區甲基化水平尚有待深入的研究。

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Influence of atorvastatin in Bcl-2 methylation in cultured human umbilical endothelial cells treated with homocysteine and its mechanism of anti-arteriosclerosis

LI Lu1,HOU Jian-jun2,QIU Rong-rong1,JIA Shao-bin2,CONG Guang-zhi2,SUN Na3
(1.Department of Cardiology,Wuxi Second People’s Hospital,Nanjing Medical University,Wuxi 214002,China;2.Center of Cardiology,General Hospital,Ningxia Medical University,Yingchuan 750004, China;3.Department of Cardiology,Weinan Central Hospital,Shaanxi Province,Weinan 714000,China)

ObjectiveTo investigate the influence of atorvastatin in methylation and expression level of Bcl-2 in human umbilical endothelial cells(HUVECs)treated with homocysteine(Hcy)and to expound potential mechanism of atorvastatin resisting arteriosclerosis.MethodsAfter HUVECs were treated with 0,2,4,8,16,and 32 mmol·L－1Hcy for 48 h,MTT was used to measure the inhibitory rates of HUVECs and the half inhibitory concentration(IC50).According to the experimental results,the HUVECs cultured in vitro were divided into control group(0.00 mmol·L－1Hcy),Hcy group(9.00 mmol·L－1Hcy),and atorvastatin group (9.00 mmol·L－1Hcy＋1×10－3mmol·L－1atorvastatin).After treated for 48 h,flow cytometry was used to detect the apoptotic rate of cells,the m RNA expression of Bcl-2 was analyzed by fluorescence quantitative PCR,the protein expression of Bcl-2 was detected by Western blotting method,and the methylation level of Bcl-2 promoter region was determined by nest touch-down PCR combined with methylation specific PCR(MSP).ResultsCompared with control group,the apoptotic rate of HUVECs in Hcy group was increased(P＜0.01),the mRNA and protein expression levels of Bcl-2 were significantly decreased(P＜0.01),and the Bcl-2 promoter region methylation level was also decreased(P＜0.01).Compared with Hcy group,the apoptotic rate of HUVECs in atorvastatin group was decreased(P＜0.01),the m RNA and protein expression levels of Bcl-2 gene were increased (P＜0.05),and the Bcl-2 promoter region methylation level was also increased(P＜0.05).ConclusionAtorvastatin can prevent the apoptosis of HUVECs induced by Hcy through regulating Bcl-2 methylation.

atorvastatin;atherosclerosis;homocysteine;Bcl-2 protein;DNA methylation;apoptosis

R543.5

A

2013-09-04

寧夏回族自治區科技廳自然科學基金資助課題(NZ11266)

李 錄(1978－),男,河北省張家口市人,醫學碩士,主要從事冠狀動脈粥樣硬化發病機制的研究。

賈紹斌(Tel:0951-6743232,E-mail:jsbxn＠163.com)

1671-587Ⅹ(2014)05-1002-05

10.13481/j.1671-587x.20140519